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本论文重点研究了假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)34 kD纤溶酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达,并做了一些枯草杆菌表达方面的研究。主要研究结果如下:本实验室顾从土壤中分离筛选出具有纤溶酶活性的假蕈状芽孢杆菌,且对此菌株的纤溶酶蛋白进行分离纯化,得到34 kD单一活性组分,埃德曼降解法测得N端序列为VTGTNAVGTGKGVLG。根据此十五个氨基酸在NCBI上进行比对,找到了十种100%同源蛋白序列,并根据相对应的编码序列的同源性设计了一对简并引物,并在5＇端分别加入了EcoRI和XhoI的酶切位点。以产纤溶酶的菌株假蕈状芽孢杆菌的基因组DNA为模板,利用设计的引物进行PCR,获得了一个完整的两头含酶切位点的纤溶酶基因BpFE。使用EcoRI和XhoI双酶切载体pGEX-4T-2和BpFE基因,通过连接构建了重组质粒pGEX-BpFE,并对BpFE基因进行了测序。结果表明:此细菌纤溶酶基因全长1701 bp,编码566个氨基酸。与相似性最高的序列bacillolysin(Bacillus cereusH3081.97)比仅存在5个氨基酸的差异,含有中性锌金属蛋白酶结构域。将重组质粒pGEX-BpFE利用热激转化法转化到大肠杆菌宿主菌BL21中,经IPTG、低温诱导后,SDS-PAGE显示胞内含有表达条带,表达产物的相对分子量大小为98 kD,比预计的分子量(90 kD)稍大。酪蛋白平板法和纤维蛋白板法均显示1.0 mmol/L IPTG,26℃和30℃诱导5小时后的重组菌经超声波破壁后的胞内蛋白有活性。但是大肠杆菌表达系统大部分为胞内表达,这样就为生产带来了很多的不便。而枯草芽孢杆菌由于其安全性和分泌胞外蛋白的特点,被认为是表达和分泌异源蛋白的理想受体。以pUC19-5-2为模板,通过PCR方法得到含sacB基因的启动子、200bp的类似转录终止信号的序列、核糖体结合位点及编码29个氨基酸的信号序列,将此535bp序列通过酶切连接到大肠.枯草穿梭质粒pMK4上,构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌诱导分泌型穿梭质粒pSK4。并将纤溶酶基因BpFE克隆到了pSK4载体上,待下一步进行枯草杆菌的分泌表达研究。本试验试图建立用基因工程的方法生产微生物纤溶酶的技术平台,以便进一步研究纤溶酶的功能、作用机理及在生命科学、医疗和保健等方面的应用潜力,为基因工程药物的开发奠定必要的理论和实践基础。