胰蛋白酶(Trypsin)作为丝氨酸蛋白酶,在胰腺消化酶的级联激活效应中发挥重要的作用,也可以作为酶制剂提高断奶动物蛋白饲料消化率。为了研究猪胰蛋白酶对蛋白饲料的消化作用,获得廉价,高效的胰蛋白酶,根据NCBI GenBank相关基因EST序列设计一对特异引物,以RT-PCR法从猪胰腺细胞中克隆到了含有胰蛋白酶原(PPT)基因完整开放阅读框(open reading frame, ORF)的cDNA (GenBank:FJ969506.1)。序列比较分析显示,PPT基因序列与人(Human)、牛(Bovine)、小鼠(Musmouse)、鸡(Chicken)、青鱂焦(Oryzias)、鳀鱼(Engraulis)、鲶鱼(Pangasius)胰蛋白酶基因序列之间的同源性分别为：76.6%、76.7%、78.5%、68.8%、69.0%、68.0%、67.5%。将PPT基因连接到真核表达质粒pPICZαA得到重组质粒pPICZαA-PPT,经PmeⅠ酶线性化切开后,通过电穿孔将线性重组质粒整合到毕赤酵母X-33染色体上,采用实时定量PCR对mRNA表达水平高的转化子进行筛选,RNA表达水平高的转化子进行BMGY摇瓶培养后于BMMY每隔24h补加0.5%(v／v)的甲醇,诱导96小时。在醇氧化酶1(AOX1)强启动子的作用下,实现了猪胰腺胰蛋白酶原在毕赤酵母中的表达,表达产物在a-因子信号肽的引导下成功地分泌到胞外。用Ni Sepharose High Performance亲和层析柱纯化重组蛋白,目的蛋白经SDS-PAGE检测后确定约为30kDa的重组表达产物,与预期目的蛋白产物大小基本相符。该重组蛋白酶的表达对其在饲料中的应用研究提供了条件。