细胞周期调控是维持细胞正常增殖和基因组稳定的核心与基础。细胞周期Gl/S检验点是监测细胞是否进入分裂周期,决定DNA复制起始的重要关卡,在酵母中被称为“START”检验点,哺乳动物中称为限制性点（Restriction Point）。细胞周期Cdk1蛋白是真核生物G1/S转换的关键激酶,其调控机制成为细胞增殖研究的核心。酿酒酵母作为最简单的真核模式生物,在细胞周期调控领域做出突出贡献,也为癌症关键基因的功能解析奠定了模式基础。著名抑癌基因Rb、p53、p21等均参与G1/S检验点调控,其突变是导致癌症发生发展的关键因素。Rb酵母同源蛋白Whi5的功能解析极大促进其抑癌机理的阐明。上世纪80年代开始,科学家们在模式生物中试图寻找抑癌基因p53和p21功能同源物,从而简化抑癌机制的研究。本课题组前期鉴定酿酒酵母一个新蛋白YPL014W参与细胞周期G1/S转换,将其命名为Cip1（Cdk1 inhibitor protein）,并提出Cip1是人类p21蛋白的功能类似物。Cip1蛋白特异性结合G1期Cln3-Cdk1复合体,并抑制其活性。本课题研究发现敲除Cip1蛋白已知底物Cln3并不能挽救Cip1过表达导致的细胞周期阻滞,推测Cip1可能还有其它底物。通过免疫印迹及qPCR 比较cln3△突变体和cln3△Cip1△突变体中S期标志基因CLN2的表达情况,发现cln3△Cip1△突变体细胞更早进入S期。该结果进一步证明细胞周期G1/S转换过程中,Cip1具有不依赖于Cln3-Cdk1的另一条调控通路。为寻找Cip1另一调控通路靶蛋白,本研究结合免疫共沉淀和质谱鉴定筛选分析Cip1相互作用的一系列新蛋白。通过对Cip1互作蛋白的功能注释,利用酵母双杂和免疫共沉淀验证,证明Ccr4-Not复合物的两个亚基Ccr4和Caf120均与Cip1蛋白相互作用。并且发现Cip1同功能蛋白p21和人Ccr4也有类似相互作用。互作蛋白质筛选表明酵母和人细胞Ccr4蛋白是Cip1/p21另一调控通路的候选新靶标。已有研究表明Ccr4参与调控WHI5基因mRNA稳定性,从而调控细胞周期G1/S转换,其具体分子机制尚不明确。本课题利用蛋白质瞬时降解技术,构建Ccr4条件缺失突变体,证实Cln3和Ccr4同时缺失存在合成致死的遗传学效应,表明Ccr4与Cln3位于两条并行通路参与调控细胞周期G1/S转换。此外,本研究发现分别过量表达Cln3或Cafl20部分回复Cip1过表达导致的细胞生长缺陷,表明Cip1负调控Cln3和Ccr4两条并行通路。Whi5（Rb同源蛋白）是已知的G1/S转录阻遏蛋白,其活性分别受Cln3和Ccr4调控。本研究发现敲除WHI5可以挽救Cip1过表达导致的细胞周期阻滞。综上所述,Ccr4和Cln3是共同抑制Whi5的两条并行途径,受Cip1负调控。此外,通过突变体遗传学分析和酵母双杂检测,初步推测Thr135是Cip1一个重要的磷酸化位点,其磷酸化可能介导其对Cln3和Ccr4的调控。本研究证明Cip1充当双重阻遏物,负调控Cln3-Cdk1和Ccr4-Cafl20复合物,从而保持Whi5活跃,阻断SBF介导的Gl/S基因转录。Cip1调控细胞周期G1/S转换工作模型的新发现推进了对真核生物细胞周期调控机制的认识,也为深入研究人类抑癌分子机制提供理论基础和新思路。