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研究背景糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病微血管并发症之一,其特征是尿蛋白渐进性增加和肾功能逐渐降低,并最终进展为终末期肾病。足细胞损伤是糖尿病肾病进展的关键细胞事件,也是导致肾脏损伤的重要因素。因此,明确糖尿病肾病足细胞损伤的分子机制对于疾病的治疗及临床标记物的发现具有重要意义。脂质代谢紊乱是伴随糖尿病肾病足细胞损伤进展的重要现象,并且脂质紊乱会进一步促进肾小球区域免疫微环境的改变,导致疾病进展。肾脏区域脂质代谢异常及其引发的足细胞损伤机制复杂且尚不明确,揭示其中关键媒介分子并解析其在疾病中的作用对于DN的防治具有重要意义。磷脂酶A2（phospholipaseA2,PLA2）是一类能催化磷脂甘油分子上二位酰基的水解酶,是介导花生四烯酸代谢及多种细胞活性物质产生的关键分子。目前对于PLA2受体的研究在肾脏领域取得显著的成效,然而PLA2本身在肾病中的作用仍未被完全阐释清楚。PLA2按照水解位点的不同可以大致分为六类,分别是分泌型、胞浆型、非钙离子依赖型、乙酰水杨酸型、溶酶体型和脂肪特异型。通过对多种肾脏疾病肾脏组织进行测序分析发现,PLA2G12B（phospholipase A2 group XIIB）在多种肾脏疾病中显著升高。PLA2G12B属于分泌型的磷脂酶A2家族,与同家族的其他成员不同,PLA2G12B的活性部位发生了突变,使其磷脂酶的活性大大降低,但其在脂质合成及运输的调节过程起到重要作用。本研究首次发现PLA2G12B参与了 DN足细胞损伤过程,并且PLA2G12B可以影响足细胞中的脂肪酸合成。机制上,我们通过RNA-seq筛选发现PLA2G12B可以通过Notch3信号通路来实现对足细胞内脂肪酸合成的调控,最终导致DN足细胞损伤。研究目的（1）检测DN病人血清,肾活检切片中PLA2G12B的表达情况。同时,建立多种DN小鼠模型,验证其表达模式。（2）研究PLA2G12B在DN,尤其是足细胞脂质代谢中的作用。（3）解析PLA2G12B在DN进展中发挥作用的分子机制。研究方法与结果第一部分:PLA2G12B在糖尿病肾病中的表达模式1.1临床DN病人血清中蛋白水平及肾组织标本中PLA2G12B的蛋白表达均水平显著升高,并与肾脏功能呈负相关（1）收集DN患者及正常人血清,使用Elisa试剂盒检测血清中PLA2G12B的含量,结果显示与正常对照相比,DN病人血清中PLA2G12B的水平显著增加,并且PLA2G12B的表达水平与尿蛋白、血清肌酐（Scr）呈正相关,与估算的肾小球滤过率（eGFR）呈负相关,提示PLA2G12B的表达水平升高有可能促进DN进展。（2）使用免疫组化染色检测DN及其他肾小球疾病患者肾活检病理切片中PLA2G12B的表达,结果显示DN、FSGS和MN患者肾小球中PLA2G12B表达增加。（3）使用正常人及DN患者血清刺激足细胞,通过Western Blot及RT-qPCR检测足细胞中PLA2G12B的蛋白及mRNA水平,结果显示PLA2G12B表达显著增加。1.2 DN动物模型中PLA2G12B的表达情况（1）使用Western Blot、RT-qPCR及免疫组化染色检测db/db小鼠肾皮质中的表达情况,结果显示,db/db小鼠肾皮质中PLA2G12B的蛋白及mRNA水平均显著升高,且多集中在肾小球部位;STZ/HFD小鼠显示出同样的结果。（2）使用足细胞标志物Synapodocin与PLA2G12B进行免疫荧光双标实验,结果显示PLA2G12B在db/db小鼠肾小球的足细胞中表达水平升高,STZ/HFD小鼠显示同样的结果。1.3体外模拟DN检测足细胞中PLA2G12B的表达情况在体外实验中,采用HG、AGEs及PA处理足细胞,Western Blot及RT-qPCR检测足细胞中PLA2G12B的蛋白及mRNA的水平,结果显示PLA2G12B在足细胞表达中显著增加。第二部分:PLA2G12B在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用与机制2.1构建PLA2G12B敲除小鼠构建PLA2G12B全身敲除小鼠,通过鼠尾基因型鉴定证明PLA2G12B敲除成功。2.2小鼠中PLA2G12B缺失可改善DN造成的肾损伤利用WT及Pla2g12b-/-小鼠进行STZ/HFD模型构建（1）收集小鼠尿液,测量小鼠尿液中尿蛋白/血肌酐比值（UACR）,结果显示与正常对照组小鼠相比,STZ/HFD小鼠中UACR 比值升高,而在体内敲除PLA2G12B后明显下降。（2）提取小鼠肾皮质mRNA,通过RT-qPCR检测小鼠体内IL-6的表达情况,结果显示与正常对照组小鼠相比,STZ/HFD小鼠体内IL-6表达升高,而在体内敲除PLA2G12B后有所下降。（3）对小鼠肾脏石蜡切片进行PAS染色,果显示PLA2G12B的缺失可明显改善由STZ/HFD诱导的肾脏损伤。2.3细胞中沉默PLA2G12B可以改善由高糖诱导的足细胞损伤（1）在体外对足细胞转染PLA2G12B的小干扰RNA,使用RT-qPCR检测沉默效率,结果显示PLA2G12B沉默成功。（2）使用RT-qPCR检测炎症因子的变化情况,结果显示足细胞中沉默PLA2G12B后能明显改善由HG处理导致的炎症因子MCP-1、TNF-α及IL-1β表达的升高。（3）使用细胞流式术检测足细胞凋亡情况,结果显示足细胞中沉默PLA2G12B后可以改善由HG处理导致的细胞凋亡数。（4）Western Blot检测足细胞标志物Nephrin和Podocin的表达情况,结果显示沉默PLA2G12B后可以改善由HG处理导致的Nephrin和Podocin的降低。（5）F-actin荧光染色检测足细胞骨架,结果显示沉默PLA2G12B后可以改善由HG处理导致的细胞骨架重排。2.4 P LA2G12B影响足细胞中的脂质沉积（1）Nile Red染色检测足细胞中脂质沉积情况,结果显示足细胞中沉默PLA2G12B后可以减少由于HG处理造成的脂滴沉积,而过表达PLA2G12B则加重脂滴沉积现象。（2）RT-qPCR检测足细胞中脂质合成相关分子的表达,结果显示沉默PLA2G12B后可改善由HG诱导的SREBP1及PPAR-γ的升高。2.5 PLA2G12B在足细胞中调控Notch3的表达RT-qPCR及Western Blot检测足细胞中Notch3的表达,结果显示足细胞中沉默PLA2G12B能明显恢复HG诱导的Notch3表达水平升高。2.6 PLA2G12B正调控Notch3-SREBP1/PPAR-γ通路参与足细胞损伤（1）RT-qPCR检测足细胞中SREBP1及PPAR-γ的变化情况,结果显示足细胞中沉默Notch3可明显改善过表达PLA2G12B导致的SREBP1及PPAR-γ的升高。（2）Nile Red染色检测足细胞中脂质沉积的情况,结果显示沉默Notch3后可显著改善由过表达PLA2G12B造成的脂质沉积。（3）F-actin荧光染色检测足细胞骨架的损伤情况,结果显示足细胞中沉默Notch3可以明显改善过表达PLA2G12B导致的细胞骨架重排。（4）RT-qPCR检测足细胞中炎症因子的变化情况,结果显示沉默Notch3可明显改善过表达PLA2G12B导致的炎症因子的表达水平升高。结论与创新性1.本课题在临床标本、动物模型及体外实验三个层面上首次发现PLA2G12B在DN中表达增加,且其表达水平与Scr和尿蛋白呈正相关,与估算的肾小球滤过率呈负相关,首次发现PLA2G12B具有作为肾脏疾病的生物标志物的潜力。2.本课题在实验中证明PLA2G12B的缺失可明显改善糖尿病肾病中的足细胞损伤。3.本课题首次发现PLA2G12B在肾脏的功能与作用,并对其作用机制进行了初步探讨,证明PLA2G12B通过Notch3-SREBP1/PPAR-γ通路调节足细胞中的脂质沉积。