研究背景醛酮还原酶家族1B10（AKR1B10,也称为似醛酮还原酶-1,即ARL-1）是一个新近发现的由肝细胞癌中分离出来的蛋白。它与醛酮还原酶家族1B1（AKR1B1,即AR）有超过70%的氨基酸序列相同。与AKR1B1不同,AKR1B10并不在人体各个组织都有所表达,AKR1B10蛋白特定表达于胃肠道,在肝脏也有少量表达。然而,AKR1B10蛋白在肝癌,吸烟者的肺鳞状细胞癌和腺癌中表达上调,并且它还是肿瘤诊断和预后的标记物。AKR1B10是单倍体的胞浆蛋白,可以催化一系列羰基（醛和酮）还原。近来研究表明,AKR1B10影响细胞的增生以及克隆的形成和细胞对丙烯醛及巴豆醛的敏感性,表明它对细胞免受羰基物质的毒害起保护作用,但是,对于它具体的生物学功能知之甚少。羰基是亲电子化合物,如丙二醛和丁烯醛,在碳水化合物和脂类代谢过程中持续在细胞内产生,也是胃肠道疾病及肿瘤的重要病原。而外源性羰基广泛存在于空气、水、水果、蔬菜、鱼类、肉类和饮料中。同时由于氧化应激导致细胞内的碳水化合物代谢和脂类超氧化可持续产生内源性羰基。羰基可以同蛋白、肽和氨基酸的自由氨基和巯基反应,形成共价修饰的产物。这些非特异性共价修饰可能导致蛋白质失去功能,阻止细胞内蛋白质水解和解聚。蛋白也可能作为第二信使、自身抗原或蛋白体抑制剂,引起细胞破坏或自身免疫性疾病。羰基与DNA形成复合物能阻断DNA聚合酶引导的半保留复制,阻止RNA聚合酶引导的转录,引起DNA突变和断裂。有证据显示羰基引导的DNA修饰的病理作用,导致发生突变、产生肿瘤和其它衰老相关的疾病。因此,饮食中的亲电子羰基是胃肠道疾病重要的病原。通过食物摄入,胃肠道细胞持续不断的暴露于各种不同的反应羰基。长期羰基刺激,即使是小量的,也可能产生胃肠道细胞的癌变。例如,暴露于己二烯醛的F344大鼠导致胃粘膜增生、乳头状瘤和癌症,而在结肠粘膜高水平的丙二醛有致病性,特别是在溃疡性结肠炎中与肿瘤损伤相关。另外,消耗酒精引起乙醛的局部积累,被认为是结肠癌和胃癌的局部致癌因子。但是,宿主对这些饮食中和细胞代谢产生的毒素的防御机制还不十分清楚。本研究的意义在于,从分子生物学角度,阐述AKR1B10参与机体对外源性和内源性羰基侵害的保护机制,希望为进一步阐明肿瘤发生的机理和寻找防治肿瘤的新药物提供理论依据。方法第一部分:基因重组增强型绿色荧光蛋白/醛酮还原酶1B10（EGFP—C3/AKR1B10）质粒的构建,AKR1B10蛋白的纯化及制备AKR1B10抗体为了监测细胞的转染效率,采用DNA重组技术,将人全长AKR1B10插入到EGFP—C3载体中,经酶切等方法鉴定目的基因连接成功。使用pQE原核蛋白表达体系纯化AKR1B10和AKR1B1蛋白,得到高纯度的AKR1B10蛋白用于酶动力学检测,AKR1B1作为对照。使用SulfoLink Immobilization Kit制备高特异性的AKR1B10抗体。第二部分:AKR1B10蛋白酶动力学检测在高浓度底物的动力学分析中,使用分光光度计检测340纳米处吸光度的降低反映酶的活性,减少的NADPH可以用氧化的NADPH/min/mg protein表示。在生理状态下,人类暴露于羰基的浓度较低,为了了解AKR1B10在生理状态下的解毒功能,我们使用高压液相仪（HPLC）来监测低浓度羰基及其耦合物时酶催化能力,并用质谱仪证实酶还原产物。第三部分:AKR1B10蛋白对293T细胞的保护作用用荧光显微镜观察293T细胞转染EGFP-C3/AKR1B10和EGFP—C3的转染效率。由Western blot检测EGFP-C3/AKR1B10的蛋白表达。用甘油醛作为底物,观察细胞内异位表达的EGFP-C3/AKR1B10蛋白是否具有功能。采用MTT比色法检测不同浓度HNE对转染后细胞的细胞毒作用。HPLC观察HNE在转染后细胞内的代谢。结果1、成功构建EGFP—C3/AKR1B10质粒,并提取高纯度AKR1B10蛋白及高特异性的抗体。2、纯化的AKR1B10蛋白的稳态动力学参数（Km和Kcat）分别为:丙烯醛为110.1±12.2μM和115.9±7.8 min^-1;丁烯醛为86.7±14.3μM和103.4±3.5min^-1;HNE为30.9±7.1μM和120.7±6.5min^-1;己烯醛为60.6±18.5μM和97.4±8.0 min^-1;己二烯醛为95.7±5.6μM和82.8±7.4 min^-1。更重要的是,HPLC检测AKR1B10在低底物浓度时仍具有酶活性,分别为:丁烯醛为0.90μM,HNE为0.10μM,己烯醛为0.10μM,和己二烯醛为0.05μM。除了GSH-HNE外,AKR1B10蛋白对其它谷胱甘肽羰基耦合物也具有催化活性。3、EGFP-C3/AKR1B10的转染效率能够达到85-90%。Western blot检测EGFP-C3/AKR1B10（65kd AKR1B10加EGFP-C3）蛋白表达阳性,对照组蛋白表达为阴性。以甘油醛为底物,转染EGFP-C3/AKR1B10的293T细胞的还原活性增加了4倍。MTT比色检测不同浓度的HNE对转染AKR1B10的293T细胞的杀伤率比对照组明显减少,差异有显著性。4、用1μM和5μM的HNE处理转染细胞,在不同的时间点用HPLC检测剩余HNE和产生的1,4-二羟基呫吨醇（DHN）的量。表达EGFP-C3/AKR1B10蛋白的293T细胞,HNE在30秒内即被还原为DHN,在1 1/2 min时大约一半的5μM的HNE还原为DHN。但转染空载体的293T细胞,HNE的清除率明显减慢,剩余大部分的HNE,检测不到还原产物DHN。结论1、重组EGFP—C3/AKR1B10质粒带有绿色荧光蛋白便于观察,转染效率高,构建周期短。His tag蛋白提纯方法简单,蛋白纯度高。AKR1B10抗体的特异性强,效价高。2、AKR1B10蛋白比AKR1B1蛋白对自由羰基有好的底物亲和力和产物转换效率。AKR1B10蛋白可以还原纳摩尔浓度的底物,表明生理状态下AKR1B10对细胞毒性羰基物质有重要的解毒功能。3、外源性EGFP-AKR1B10融合蛋白和内源性的AKR1B1对甘油醛都有还原作用,但细胞成活率实验表明,转染EGFP-AKR1B10降低HNE的细胞毒性作用明显强于内源性的AKR1B1。4、转染后的293T细胞试验证实,AKR1B10可以迅速代谢细胞内毒性和亚毒性水平的HNE转化为DHN,而AKR1B1却不能迅速代谢细胞内毒性和亚毒性水平的HNE转化为DHN。