论文部分内容阅读
志贺菌属细菌是急性感染性腹泻的主要病原体之一，由志贺菌引起的细菌性痢疾的发病率居我国感染性腹泻病首位。随着抗生素的广泛使用，志贺菌的耐药现象越来越普遍，已成为严重的公共卫生问题，耐药基因的水平转移是细菌耐药性增强的主要方式之一。成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat, CRISPR）是近年来发现的与细菌横向基因转移有密切关系的一个遗传结构，能够有效地防御基因的水平转移。因此了解细菌中CRISPR的存在与否及其特征，对于探讨细菌耐药状况及其机制，尤其了解细菌横向基因转移情况具有重要意义。而CRISPR在志贺菌中的分布情况未见报道。本课题检测实验室保存的志贺菌CRISPR系统相关基因并测序，分析志贺菌中CRISPR的分布情况及其特征，为进一步揭示志贺菌横向基因转移规律及其与细菌耐药等特性的关系提供基础资料。研究方法对196株志贺菌进行生化鉴定，其中江西分离株9株，河南分离株176株，北京分离株5株，中国药品检定所6株；K-B纸片法进行药敏试验；PCR扩增志贺菌CRISPR相关序列；DNA测序，并对核苷酸序列进行分析；采用随机引物法标记制作探针，斑点杂交。结果1.在196株志贺菌株中均检测出cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因。以志贺菌分离时间的中位数2004年为分界点分为两组，其中CRISPR-S1、CRISPR-S4在两组之间的分布差异有统计学意义；而CRISPR-S2、CRISPR-S3在两组的分布没有差异。2.在90株志贺菌中共检出260条间隔序列，与CRISPR DB数据库比对，207条是已有的志贺菌间隔序列，另外53条是新发现的志贺菌间隔序列。3.志贺菌CRISPR同一个位点的重复序列相对保守，有的重复序列在5’端或3’端会出现碱基缺失和变异。4. BLAST发现与cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因高度同源的细菌包括志贺菌和大肠杆菌。志贺菌CRISPR系统的重复序列和间隔序列在CRISPR DB数据库BLAST，与大肠杆菌、沙门氏菌中甚至一些亲缘关系较远的菌株同源性较高。5.选取3株志贺菌进行cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因测序，测序结果与GenBank上公布的含有CRISPR的Shigella sonnei53G进行比对，发现cas1(a)基因、cas1(b)基因和cas2基因均有不同程度的差异，进一步做药敏试验，发现cas2基因的差异和细菌耐药程度存在关联。6.设计出志贺菌cas基因和重复序列探针，地高辛标记后与志贺菌基因组DNA进行斑点杂交，产生杂交信号。结论1. CRISPR系统在志贺菌中广泛存在；不同时间分离的志贺菌的CRISPR位点S1和S4分布有差异。2. Cas2基因差异与志贺菌耐药程度有关。3.志贺菌CRISPR系统与大肠杆菌的同源性较高。4.设计出志贺菌CRISPR系统相关的PCR引物；实现了志贺菌CRISPR系统的探针制备及杂交方法的建立。