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质子转运载体15家族(Solute carrier 15 family,SLC15)又被称为小肽转运载体家族,主要位于细胞膜上,能够利用电化学梯度将短链肽和拟肽类物质转运进入细胞内。SLC15家族成员主要包括SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4,目前鲜有报道能够全面地研究这些小肽转运载体在成年奶牛上的表达差异。小肽转运载体能够转运肠道中的营养物质,它也受这些营养物质调控。丙氨酰谷氨酰胺二肽(alanyl-glutamine,Ala-Gln)作为小肠的主要能源物质,它对肠道中小肽转运载体的调控也鲜有研究。因此本试验研究SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4在成年奶牛组织器官中的表达情况以及Ala-Gln对奶牛小肠上皮细胞(Bovine intestinal epithelial cells,BIECs)中小肽转运载体的调控作用,为SLC15家族在成年奶牛中的生物学功能以及Ala-Gln对BIECs的调控机制提供科学依据。试验一、小肽转运载体在成年奶牛组织器官中的表达试验选取3头健康的成年荷斯坦奶牛进行屠宰,采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠。试验采用实时荧光定量PCR法对器官组织中的SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4 mRNA进行分析;采用Western Blot方法对器官组织中的SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白进行分析。试验结果发现SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4mRNA在器官组织中均能表达,但是在回肠中没有发现SLC15A2 mRNA的表达。SLC15A1在成年奶牛的肺脏、肾脏和空肠的表达极显著高于其它器官组织(P<0.01);SLC15A2在肾脏组织中的表达量均极显著高于其它器官组织(P<0.01);SLC15A3mRNA在瘤胃、脾脏、结肠和肺脏中的表达极显著高于其它器官组织(P<0.01);SLC15A4在脾脏,肾脏,肝脏,盲肠,结肠和肺脏中均有较高的表达水平。试验二、奶牛小肠上皮细胞原代培养及其小肽转运载体的表达在无菌条件下分离奶牛小肠上皮组织,用胰酶消化获得BIECs并纯化,免疫荧光和琼脂糖凝胶电泳鉴定BIECs,实时荧光定量PCR检测细胞内SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和 SLC15A4 mRNA 表达;Western Blot 检测细胞中 SLC15A1、SLC15A2 和 SLC15A4 蛋白表达。结果表明,BIECs的细胞质中均含有细胞角蛋白18荧光,在细胞中检测到绒毛蛋白、上皮细胞钙粘蛋白和小肠脂肪酸结合蛋白基因的表达证实细胞为纯化的BIECs。细胞中SLC15A1 mRNA 的表达量极显著高于 SLC15A2、SLC15A3 和 SLC15A4 mRNA(P<0.01)。SLC15A1蛋白的表达量最高,极显著高于SLC15A2和SLC15A4(P<0.01)。试验三、Ala-Gln对奶牛小肠上皮细胞中小肽转运载体表达的影响不同时间和浓度的Ala-Gln培养BIECs,确定最佳培养时间和浓度。用实时荧光定量PCR 检测 Ala-Gln、丙氨酸(L-alanine,Ala)和谷氨酰胺(L-glutamine,Gln)对 BIECs中小肽转运载体及其相关基因mRNA的影响,Western Blot检测Ala-Gln、Ala和Gln对BIECs中SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白的影响。结果发现,Ala-Gln能够促进BIECs增殖,其中1mMAla-Gln在4h时极显著促进细胞增殖(P<0.01),并且该组中SLC15A1 mRNA、SLC15A2 mRNA、SLC15A3 mRNA 和 SLC15A4 mRNA 的表达量极显著高于其它各组(P<0.01),显著促进SLC15A1蛋白的表达(P<0.05)。Cdx2和PPAR-α mRNA的提高能够上调SLC15A1mRNA的表达量。Ala-Gln培养BIECs后发现磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,AKT)信号通路关键基因的表达都显著升高(P<0.05)。综上,SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4在成年奶牛中广泛表达,但是它们在器官组织中的表达水平存在较大差异。SLC15A1 mRNA在BIECs中表达量最高,主要是通过Cdx2和PPAR-α基因调控的。Ala-Gln能够上调小肽转运载体的表达,并且能上调PI3K/AKT传导信号中关键基因的表达。