哺乳动物防御素由于具有抗菌能力强、抗菌作用广泛,不易使病源微生物等产生耐药性等优点而受到人们广泛关注。本实验在课题组前期研究的基础上,分别对猪β防御素2进行了定点突变和DNA改组技术,并利用大肠杆菌表达系统对得到的重组pBD-2进行表达,以及功能分析,从而进一步探讨其结构与功能关系。其主要内容如下:1.猪β防御素2基因的定点突变及活性分析在实验室前期对pBD-2进行定点突变获得突变体的基础上,进一步进行定点突变,以期增加更多的正电荷数,从而提高pBD-2的生物活性;在对突变体进行理化性质及三维结构分析的基础上,克隆并构建了BL21-PET-mpBD2-DD1~DD6工程菌株,结果显示:突变体均对S.aureus ATCC 25923和E.coli ATCC 25922有抗菌活性,但是其抑制活性较弱。突变体的溶血率很低,在-10%~10%之间,对红细胞几乎没有毒害作用。突变体DD2、DD3在不同浓度的NaCl溶液中仍具有较好的抑菌活性,说明DD2、DD3具有较好的盐离子耐受性。2.猪β防御素2基因的DNA改组及活性分析以实验室前期构建的定点突变pBD-2基因为基础,进行DNA改组,获得了17个改组后的突变体,进一步筛选了6个突变体DS1~DS6,预测理化性质以及三维结构与表面电荷分布情况,构建BL21-PET-mpBD2-DD1~DD6工程菌株,结果显示:改组得到的突变体DS1~DS6在不同程度上对S.aureus ATCC 25923和E.coli ATCC 25922都表现出了较强的抗菌活性。突变体的溶血率很低(DS2除外),普遍在0%~10%左右,对猪红细胞基本无害。突变体DS2、DS3和DS6在不同浓度的NaCl溶液中仍表现出了抑菌活性,说明改组后的突变体具有较好的盐离子耐受性。以上结果表明,通过对pBD-2的定点突变或者DNA改组得到了具有抗菌活性的新型猪β防御素2,但是并没有获得对S.aureus和E.coli抑制活性明显提高的突变体,多数突变体在不同时间点表现出于与pBD-2相似的抑菌活性;突变体的溶血率普遍较低,对猪红细胞毒性小;并且多数突变体对盐离子溶液耐受性好。结果也显示,猪β防御素2的抗菌活性并不单单与净正电荷数的增加有关,可能也与其他因素相关,如总平均亲水性、三维结构以及电荷分布等。