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随着沙门菌多重耐药菌株的不断出现,对其耐药机制的研究成为当下的重点。经证实,双组分信号转导系统和多重耐药外排泵在沙门菌耐药机制中发挥着重要作用。此外,acrB的存在可能会掩盖其他外排泵的功能。因此,本研究采用自杀质粒p LP12介导的同源重组系统构建鼠伤寒沙门菌体外诱导环丙沙星耐药株CR、CR△bae SR的acrB基因缺失株,比较分析缺失前后菌株的药物敏感性(MIC)和生物学功能差异。采用转录组学技术结合EMSA试验寻找Bae R的潜在靶基因,并在蛋白质翻译后修饰水平利用磷酸化定量蛋白质组学技术筛选受试菌株的差异表达磷酸化蛋白,旨在不同层次下阐明双组份系统Bae SR和外排泵Acr B在鼠伤寒沙门菌中的耐药调控机制。主要研究内容与结果如下:1.鼠伤寒沙门菌acrB基因缺失株的构建及生物学特性分析利用p LP12质粒结合正、反向筛选技术构建CR、CR△bae SR的acrB基因缺失株,用氯霉素抗性正向筛选,vmt基因(带有阿拉伯糖诱导的自杀性致死基因)反向筛选,进一步通过PCR和序列测定验证。结果表明,成功筛选得到了无抗生素标记的鼠伤寒沙门菌基因缺失突变株CR△acrB和CR△bae SR△acrB。比较分析三株菌的MIC、生长特性、生物膜形成能力和运动性,结果表明,与标准株CR相比,CR△acrB对头孢噻呋、阿奇霉素的MIC下降了87.5%,阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星的MIC下降了75%,其余7种(氨苄西林、阿米卡星、安普霉素、四环素、强力霉素、氟苯尼考、氯霉素)药物的MIC下降了50%;与CR△acrB相比,CR△bae SR△acrB对青霉素类(氨苄西林和阿莫西林)MIC未发生变化,对氟苯尼考和氯霉素的MIC下降了87.5%及以上,对其他药物的MIC下降了50%;缺失前后菌株的生长速度无明显差异,说明bae SR、acrB基因的缺失并不影响鼠伤寒沙门菌的生长速率;与CR相比,CR△acrB和CR△bae SR△acrB生物膜形成能力均明显减弱(P<0.01),acrB和bae SR双基因缺失株下降幅度更为明显;测量受试菌株的菌圈直径发现,其运动性变化与生物膜变化趋势一致,表明Acr B和Bae SR可通过调节细菌生物膜形成、运动性等协同调控沙门菌的多重耐药性。2.RNA-Seq筛选bae SR、acrB基因缺失前后的差异基因并鉴定Bae R的下游靶点以|log2(Fold Change)|>1且qvalue<0.005为筛选条件,CR△acrB/CR比较组共筛选到1320个差异表达基因,894个下调,426个上调;CR△bae SR△acrB/CR比较组共筛选到1377个差异表达基因,972个下调,405个上调。对差异基因进行生物信息学分析,结果显示差异基因主要富集在代谢途径、ABC转运系统、双组分信号转导系统、鞭毛组装、β-内酰胺抗性等通路。根据基因注释和文献报道共筛选出16个耐药相关差异表达基因,涉及外排泵、生物膜、双组分系统、趋化性等,随机筛选7个差异表达基因经q RT-PCR检测结果与其基本一致,证实了RNA-Seq分析结果的可靠性。利用p Cold I表达载体对Bae R蛋白进行原核表达,经Ni-His resin柱亲和层析纯化,并进行Western blot验证,结果表明Bae R蛋白既能以包涵体形式存在,也可在上清中表达,取上清中表达的蛋白,经纯化后验证,在28 KD处明显出现目的条带,表明Bae R蛋白成功表达并具有活性。选取csg F、stm1545、fli A、mdt C、pmrf和stm3031作为Bae R的潜在靶基因,根据其启动子区域合成含有生物素标记的DNA片段,进行体外凝胶阻滞试验,结果表明Bae R可直接调控mdt C和pmr F的表达从而调控沙门菌的耐药性。3.磷酸化定量蛋白质组学筛选bae SR、acrB基因缺失前后的差异表达蛋白利用蛋白定量技术和修饰富集技术相结合,对受试菌株中翻译后修饰进行相对定量,筛选出耐药相关差异修饰蛋白质,结果显示,四个受试菌株中共鉴定出213个修饰蛋白,共包含363个修饰位点。其中,以CR△bae SR/CR为比较组,共鉴定出80种差异表达蛋白(34种下调,46种上调);以CR△acrB/CR为比较组,共鉴定出128种差异表达蛋白(103种下调,25种上调);以CR△bae SR△acrB/CR为比较组,共鉴定出96个差异表达蛋白(66个下调,30个上调)。对所有筛选到的差异表达蛋白进行生物信息学分析,蛋白质磷酸化广泛参与细菌细胞的转运、转录、各种代谢途径、毒力和耐药性等过程。对差异蛋白进行功能分类,共鉴定出21种与细菌耐药性相关的蛋白,4种与毒力相关的蛋白。综上所述,本研究通过自杀质粒p LP12介导的同源重组系统成功构建acrB基因缺失株CR△acrB、CR△bae SR△acrB,药物敏感性结果显示,bae SR、acrB基因缺失后菌株对多种抗生素的敏感性均有所提高。结合生物学特性、转录组学和EMSA层面的变化,发现bae SR和acrB能够调节鼠伤寒沙门菌的多种耐药途径如生物膜形成能力、运动性、外排泵的表达、双组分系统和细菌趋化性等,与此同时,Bae R也能直接调控mdt C和pmr F的表达,从而参与调控鼠伤寒沙门菌的耐药性。除此之外,磷酸化定量蛋白质组学结果显示,在蛋白质翻译后修饰水平下,磷酸化参与调节鼠伤寒沙门菌的耐药性。