【摘 要】
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泌乳性状是奶山羊重要的经济性状。乳的营养成分会影响其营养价值、工艺特性和乳制品的质量,从而影响到产业经济效益。乳蛋白是评价乳品质的一项重要指标,在羊乳中,酪蛋白占乳总蛋白的80%以上,是乳蛋白的主要组成部分。酪蛋白分为四种,分别是αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白。人乳中几乎不含αs1-酪蛋白,山羊乳中的αs1-酪蛋白占酪蛋白总量的5.6%。αs1-酪蛋白是乳中主要的过敏原蛋白,容易诱发婴幼儿湿
【基金项目】
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陕西省重点研发计划（编号:2018ZDCXL-NY-01-02,2020ZDLNY02-01,2021NY-001,2021ZDLNY02-01,2021ZDLNY02-06）； 陕西省农业科技创新转化项目（NYKJ-2020-YL-05和NYKJ-2020-YL-04）；
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泌乳性状是奶山羊重要的经济性状。乳的营养成分会影响其营养价值、工艺特性和乳制品的质量,从而影响到产业经济效益。乳蛋白是评价乳品质的一项重要指标,在羊乳中,酪蛋白占乳总蛋白的80%以上,是乳蛋白的主要组成部分。酪蛋白分为四种,分别是αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白。人乳中几乎不含αs1-酪蛋白,山羊乳中的αs1-酪蛋白占酪蛋白总量的5.6%。αs1-酪蛋白是乳中主要的过敏原蛋白,容易诱发婴幼儿湿疹、腹痛、腹泻等过敏反应,92%的过敏婴幼儿患有多种过敏症状,严重时引起过敏性休克,危及生命。研究发现miRNAs可通过靶向mRNA的3′UTR区参与调控mRNA的翻译,调控细胞的增殖、凋亡。近年来,许多研究发现miRNAs在乳腺生长发育及泌乳中发挥着重要的调控作用。实验室前期研究发现miR-2284b在奶山羊泌乳前期和泌乳高峰期差异表达显著,但其对乳腺上皮细胞生长发育及泌乳的调控机理尚不清楚。利用生物信息学分析发现,miR-2284b与CSN1S1基因的3′UTR区具有可以靶向结合的位点,因此推测miR-2284b可调节αs1-酪蛋白的合成。本试验以奶山羊乳腺上皮细胞（GMECs）为研究对象,构建CSN1S1基因的CHECK2载体和pcDNA3.1过表达载体,合成miR-2284b的模拟物与si RNA-CSN1S1,采用双荧光素酶活性检测系统、EdU、CCK8和ELISA等技术,探究miR-2284b调控GMECs合成αs1-酪蛋白的分子机理,以期为构建精准而快速的改善奶山羊乳品质的方法提供试验依据。主要试验结果如下:1.MiR-2284b调控GMECs的凋亡以及αs1-酪蛋白的合成CCK8结果显示,miR-2284b显著抑制GMECs的增殖（P<0.05）,细胞凋亡检测结果表明,miR-2284b促进细胞凋亡。ELISA检测结果表明,miR-2284b极显著抑制GMECs分泌αs1-酪蛋白（P<0.01）。这些试验结果都表明,miR-2284b能够抑制GMECs合成αs1-酪蛋白,影响乳的品质。2.发现CSN1S1两个新的基因序列扩增出的CSN1S1-CDS与NCBI已知序列相比,发现CSN1S1-1在第92位点T突变成C、第108位点和274位点C突变成G,导致第31位亮氨酸变成脯氨酸、第92位谷氨酰胺变成谷氨酸;CSN1S1-2除在上述位点改变,还在第242位点缺失C碱基、第249～253位点缺失TGAGG序列,导致除上述氨基酸改变之外,第83位丝氨酸变成半胱氨酸、第84位谷氨酸变成谷氨酰胺,第81、82位2个丝氨酸缺失。3.CSN1S1-1/-2对GMECs增殖和αs1-酪蛋白合成的影响CCK8和EdU结果显示,CSN1S1-1/-2过表达都能够显著促进GMECs的增殖（P<0.05）;细胞凋亡检测结果表明,CSN1S1-1/-2过表达都抑制了GMECs的凋亡。ELISA试验表明,CSN1S1-1对GMECs中αs1-酪蛋白的合成无影响,CSN1S1-2极显著抑制GMECs合成αs1-酪蛋白（P<0.01）。4.MiR-2284b通过抑制CSN1S1基因调控GMECs中αs1-酪蛋白的合成双荧光素酶报告检测结果表明,miR-2284b可以与CSN1S1基因3′UTR区靶向结合;RT-q PCR结果和ELISA试剂盒检测表明,miR-2284b能够极显著降低CSN1S1基因在mRNA水平及蛋白水平的表达（P<0.01）。CCK8结果显示,过表达CSN1S1-1/-2能极显著消除miR-22284b对GMECs增殖的抑制作用（P<0.01）;在EdU试验中,过表达CSN1S1-2能够显著消除miR-2284b对GMECs增殖的抑制作用（P<0.05）,但过表达CSN1S1-1对miR-2284b影响GMECs增殖的结果未达到显著性水平（P>0.05）。细胞凋亡检测结果表明,CSN1S1-1/-2能消除miR-2284b对GMECs增殖的抑制作用。ELISA检测结果表明,过表达CSN1S1-1能极显著消除miR-2284b对GMECs合成αs1-酪蛋白的作用（P<0.01）,过表达CSN1S1-2能显著消除miR-2284b对GMECs合成αs1-酪蛋白的影响（P<0.05）。由此可推测,miR-2284b能够调控CSN1S1-1/-2的表达,进而调节GMECs中αs1-酪蛋白的合成。综上所述,本试验发现了2个新的编码αs1-酪蛋白基因的序列,验证了miR-2284b对奶山羊乳腺上皮细胞增殖和αs1-酪蛋白合成的影响。揭示了miR-2284b可能通过调控CSN1S1-1/-2的表达,进而调节GMECs的增殖及αs1-酪蛋白的合成。
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