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抑郁症(depression)是一种常见的精神疾病,通常以情绪低落和快感缺乏为特征。约有15～30%的严重抑郁患者对两种及两种以上的标准抗抑郁药(例如,血清素和再摄取抑制剂)无反应,被判定为患有抗治疗性抑郁(treatment-resistant depression,TRD),抑郁发生的分子机制目前未尽可知。研发TRD新型疗法受到四个主要突破的推动:(1)增加多巴胺能神经传递可改善TRD症状;(2)中枢多巴胺能神经传递低时快感不足;(3)抗抑郁药可明显增强神经可塑性;(4)氯胺酮在TRD患者中显示出抗抑郁作用,并在临床前动物模型中增强突触可塑性。因此,本实验拟探究多巴胺系统是否在氯胺酮抗抑郁作用中发挥了生物学作用,将目标集中于多巴胺五种受体中的第二受体(dopamine D2 receptor,DRD2),并在个体和细胞水平上进行试验,具体试验操作如下:试验将SD大鼠随机分为5组(n=10,雌雄各半),对照组(C组)腹腔注射生理盐水;用慢性不可预知刺激结合孤独饲养培养其余40只大鼠21d,其中1组只接受腹腔注射生理盐水,设置为模型组(D组);氯胺酮组(K组)大鼠腹腔注射氯胺酮,每7d给药一次,共3次;L组腹腔注射多巴胺第二受体抑制剂L-741,626,每7d给药一次,共3次;K+L组注射两种药物,L-741,626预先给药0.5h,给药方式同氯胺酮。对各组大鼠进行行为学测试,包括蔗糖偏好实验(sugar water preference test,SPT)、悬尾实验(tail suspension test,TST)、强迫游泳实验(forced swimming test,TST),判定抑郁样大鼠的行为学变化。每周称量一次大鼠体重并记录,探究试验期间大鼠体重变化趋势,处死大鼠后称量大鼠脑重。收集大鼠大脑伏隔核及海马提取蛋白备用。采用尼氏染色及HE染色检测大鼠大脑海马神经细胞数量;采用免疫组化检测突触蛋白PSD-95、SYN及SYP的蛋白表达量;采用高尔基染色方法检测突触可塑性。选取多巴胺能细胞——PC12细胞进行离体验证,利用皮质酮影响细胞的正常生长状态。应用CCK-8法检测皮质酮、氯胺酮、L-741,626、多巴胺第二受体激动剂普拉克索(pramipexole)的最佳浓度。即设置对照组(C组)、皮质酮损伤组(D组)、皮质酮损伤加入氯胺酮组(K组)、皮质酮损伤加入L-741,626(L组)、皮质酮损伤加入氯胺酮及L-741,626(K+L组)、皮质酮损伤加入普拉克索组(P组)。显微镜下观察细胞形态,提取细胞蛋白备用。对组织及细胞提取的蛋白采用Western blot方法检测DRD2、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β的蛋白表达变化。用ELISA试剂盒检测组织、血液、细胞中的单胺类神经递质DA及其代谢物HVA、糖皮质激素皮质酮的含量。实验结果表明:(1)结合了慢性不可预知刺激及孤独饲养的大鼠可以模拟人类社会压力导致的抑郁样状态;(2)行为学测试表明,抑郁样状态的大鼠较对照组比对糖水的偏好率降低,证明其快感的缺失;在强迫游泳实验及悬尾实验中表现为不动时间的延长,表现其行为绝望。氯胺酮可以逆转上述状态,而多巴胺第二受体抑制剂L-741,626减弱了氯胺酮的这种作用;(3)大鼠脑组织的尼氏、HE染色表明,抑郁样状态会使大鼠大脑的神经细胞发生改变,表现为部分细胞坏死,核仁不明显或消失,结构不完整。氯胺酮的使用会使脑部神经细胞的状态好转,L-741,626部分拮抗了氯胺酮的作用;(4)免疫组织化学检测突触蛋白的表达及高尔基染色表明,抑郁样大鼠的突触可塑性发生了变化,氯胺酮可使突触蛋白的表达增高,增加突触密度,L-741,626会拮抗氯胺酮的作用,表明氯胺酮可能通过多巴胺第二受体产生抗抑郁作用;(5)皮质酮可以对多巴胺能细胞-PC12细胞造成损伤,从细胞形态可以看出,氯胺酮可以对损伤细胞起到保护作用,普拉克索的使用可以提高细胞的存活率;(6)Western Blot结果表明在大鼠的海马、伏隔核以及细胞中,DRD2、p-GSK3β、GSK3β、p-AKT、AKT的蛋白表达除AKT外均出现统计学差异,但就p-AKT与AKT的比值而言,该比值也具有统计学意义,p-GSK3β与GSK3β统计学差异显著;(7)DA、HVA、CORT含量的改变肯定了抑郁样状态伴随着神经递质和糖皮质激素的变化。以上结果表明:氯胺酮可以通过多巴胺第二受体部分发挥抗抑郁作用。