RNA修饰,以N^（6）-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）为代表广泛存在于不同类型的RNA中,它参与调控许多生理过程,对mRNA的剪接、运输、稳定性和免疫耐受性都有重要影响。最新的研究表明,RNA中的m6A修饰是动态可逆的,由 FTO（fat mass and obesity-associated protein）和 ALKBH5 蛋白酶及α-酮戊二酸和Fe2+作为催化剂,催化去甲基,产生羟甲基化修饰hm6A(N^（6）-hydroxymethyladenosine)不稳定中间产物,该过程与许多人类疾病和细胞发育紧密相关。类似地,DNA中的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5mC）去甲基化是由Tet蛋白（Ten Eleven Translocation）及α-酮戊二酸和Fe^（2+）作为催化剂,催化氧化形成5-轻甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine,5hmC）等中间产物。这样的去甲基过程在DNA及RNA都存在相似的机制,即甲基化修饰可能都是由酶催化氧化产生羟甲基化修饰的中间产物,然后再还原为正常核苷的。我们猜测生物体中可能存在N^（2）-羟甲基鸟嘌呤(N^（2）-hydroxymethylguanine,hm2G),N^（4）-羟甲基胞嘧啶(N^（4）-hydroxymethylcytosine,hm^（4）C),5-羟甲基-2’-氧甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl-2’-O-methylcytosine,hm^（5）Cm),N^（6）-轻甲基-2’-氧甲基腺嘌呤(N^（6）-hydroxymethyl-2’-O-methyladenosine,hm6Am),它们是其对应甲基化修饰N^（2）-甲基鸟嘌呤(N^（2）-methylguanine,m2G),N^（4）-甲基胞嘧啶(N^（4）-methylcytosine,m^（4）C),5,2’-氧二甲基胞嘧啶(5,2-O-dimethylcytosine,m^（5）Cm),N6,2,-氧二甲基腺嘌呤(N^（6）,2’-O-methyladenosine,m6Am)在酶的作用下的去甲基中间产物。基于之前的研究报道,首先,羟甲基化修饰hm6A的稳定性不好,难以通过常规的酶解方法对其进行准确的分析,并且由于其含量很低,高含量的正常核苷会干扰羟甲基修饰的检测。其次,由于缺乏标准品进行比对,我们难以确定新的羟甲基修饰核苷是否存在于RNA上。因此,在本文的研究中,我们针对以上两个问题开发了对RNA羟甲基修饰的高准确性和高灵敏度的分析方法,本工作的主要内容如下:我们建立了一种新的酶解方法,选择磷酸二酯酶和碱性磷酸酶作为主要酶切的酶,并在温和的中性pH进行,很好地避免了常规酶解过程中高温的加热变性和酸碱性环境影响羟甲基修饰核苷的分解,通过酶解效率考察,我们在37℃,pH 7.0条件下4 h即可使15 ug的RNA完全酶解,并且羟甲基修饰核苷的含量达到最高。同时,我们参考文献的合成方法,利用自己合成的hm^（4）C、hm^（2）G、hm^（6）A、hm^（5）Cm、hm^（4）Cm、hm6Am作为标准品比对,通过二级质谱和高分辨质谱确认,大大增加了实际样品中羟甲基修饰核苷的定性准确性,基于液相色谱-质谱的高灵敏度分析,在293T细胞、HeLa细胞及甲状腺组织中检测到了六种羟甲基化修饰,减少了检测过程中的假阳性。另外,与正常人相比,我们发现m2G在甲状腺癌组织中的含量显著性升高,说明了RNA修饰可能对癌症有调控作用,为后面的病理学及生理学意义研究奠定了良好的基础。同时,这些新羟甲基修饰的发现,也进一步证明我们猜想的甲基化修饰的去甲基化机制可能是一个普遍存在的规律。