蔬菜腐霉型猝倒病病原鉴定及新型高效生防菌筛选与应用

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瓜类蔬菜猝倒病(Cucurbit damping-off)引起瓜类种子腐烂和幼苗猝倒,是蔬菜育苗生产中最严重的问题之一。引起猝倒病的病原种类多,包括腐霉、镰刀菌和立枯丝核菌等。目前,对于湖北省发生的瓜类蔬菜猝倒病病原还缺乏系统研究。化学防治是目前生产上控制瓜类蔬菜猝倒病的主要措施。然而,使用杀菌剂常常导致病原菌产生抗药性,而且污染环境,造成农药残留等问题。人们越来越关注开发包括生物防治在内的绿色防控技术。鉴此,本研究对湖北省瓜类蔬菜苗期猝倒病(以下简称瓜类猝倒病)病原种类进行了鉴定,在此基础上探讨了瓜类蔬菜猝倒病的生物防治技术。取得的主要研究结果如下:(1)明确了湖北省瓜类蔬菜猝倒病病原类群。从湖北省各地采集瓜类(西瓜、黄瓜、冬瓜、丝瓜、葫芦、甜瓜)蔬菜苗期猝倒病病害样品,分离获得了413株卵菌和真菌分离物,包括221株腐霉(Pythium spp.),占53.5%;89株镰孢菌(Fusarium spp.),占 21.6%;65 株毛霉(Mucor spp.),占 15.7%;20 株立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),占4.8%;其余18株为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea),占4.3%。腐霉主要来自西瓜(占45%)和黄瓜(占30%)。从育苗基质和土壤培育的病苗上分离的腐霉分别占60%和 47%。根据菌落特征(基内菌丝、气生菌丝、菌丝生长速度),将221株腐霉分为5类(I~V)。从各类型中挑取3~5个代表性菌株,观察它们产生的特定结构(孢子囊、雄器、藏卵器和卵孢子)的形态特征,同时克隆并分析它们的特定基因序列(ITS、Cox1、Cox2),鉴定腐霉种类。结果表明:Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类、Ⅳ类和V类菌株分别属于瓜果腐霉(Pythium.aphanidermatum)、畸雌腐霉(P.irregular)、刺腐霉(P.spinosum)、终极腐霉(P.ultimum)和未知腐霉种(Pythium sp.),分别占52%、9%、3%、30%和6%。基于ITS和Cox1序列分析结果表明:V类菌株与土栖腐霉(P.terrestris)亲缘关系较近,暂将其定为土栖腐霉。目前,土栖腐霉引起瓜类蔬菜猝倒病尚未见报道,畸雌腐霉引起瓜类蔬菜猝倒病为国内首次发现。(2)获得了高效生防菌鼠灰链霉菌JKTJ-3,发现该菌株能产生丰富的次生代谢产物以及促进植物生长的活性物质。鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)JKTJ-3对瓜果腐霉等13种病原菌抑菌带宽度达23.2 mm。被JKTJ-3抑制的瓜果腐霉菌丝表现出螺旋状卷曲及膨大等畸形症状,甚至溃解。测定了链霉菌JKTJ-3的全基因组,发现其总长为8.4 Mb,G+C含量为71.81%,预测含有7,390个蛋白质编码基因以及34个次级代谢产物合成基因簇。合成的抗菌物质包括放线菌素D(actinomycin D)和喷塔霉素(pentamycin)等。还检测出9个几丁质酶基因(第18家族)和10个葡聚糖酶基因(GH5、GH6、GH55)。HPLC-MS检测发现JKTJ-3发酵产物中含有放线菌素D。同时,在JKTJ-3培养物滤液中也检测到β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶,产量分别为6.39 U/mL和4.07 U/mL。链霉菌JKTJ-3具有溶磷和降解木质素的能力,能产生吲哚乙酸(IAA)和铁载体。在有机磷和无机磷液体培养基中培养4 d,无菌滤液中可溶性有机磷和无机磷量含量分别为35.6 mg/L和57.7 mg/L;在PDB和添加色氨酸的PDB培养液(PDB-Trp)中,IAA产量分别为12.8 mg/L和68.7 mg/L。可见,链霉菌JKTJ-3能够产生多种活性物质(抗菌物质、促进植物生长的物质)和真菌细胞壁降解酶。(3)发现了链霉菌JKTJ-3对瓜类猝倒病具有明显防治效果,并对瓜苗生长表现出促进作用。盆栽试验结果表明:用链霉菌JKTJ-3培养物或培养物滤液浸泡西瓜种籽或处理育苗基质,均明显降低西瓜猝倒病(瓜果腐霉引起)的发病率。在浸种试验中,JKTJ-3培养物和无菌滤液对西瓜猝倒病的防效分别为39.2%和50.7%;在育苗基质处理试验中(每升育苗基质添加10~300 mL无菌滤液或10~160 g麦粒培养物),添加JKTJ-3无菌滤液的防效为10.0%~51.4%,添加JKTJ-3麦粒培养物的防效为53.2%~92.4%。在施药间隔期试验中(JKTJ-3无菌滤液/麦粒培养物处理育苗基质0 d、1 d、2 d和3 d后接种瓜果腐霉),对西瓜猝倒病的防治效果达到63.3%~100%。此外,离体叶片试验表明:链霉菌JKTJ-3发酵物对南瓜立枯病、南瓜猝倒病和黄瓜蔓枯病的防效分别为86.7%、88.2%和91.8%。穴盘育苗试验表明:用链霉菌JKTJ-3发酵物(0.4%,v/v)处理育苗基质,西瓜和黄瓜壮苗指数分别提高18.1%和12.5%,根系活力显著提高。可见,链霉菌JKTJ-3能显著促进西瓜和黄瓜生长,提高瓜苗质量。上述研究结果为瓜类蔬菜猝倒病的防控提供了理论依据,链霉菌JKTJ-3的获得为防控瓜类蔬菜猝倒病提供技术支撑。
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