2H/13C双同位素示踪法研究裸子植物中纤维素与木素的连接

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在制浆过程中,由于纤维素与木素的连接,使得木素不能够完全的除去掉。因此研究出纤维素与木素以何种方式连接,连接的位置在纤维素和木素的哪个碳原子上,这对寻找一种高效的酶或仿酶体系来进行生物制浆有重要意义。本文以无水D-吡喃葡萄糖-6-D2为原料合成了糖环上六号位带有2H标记的纤维素前驱物—尿苷二磷酸葡萄糖-6-D2。采用葡萄糖乙酰化、1号位的脱乙酰基、羟基磷酸化、加氢裂解双苯环、与核苷单磷酸磷酰吗啡啉试剂的偶联缩合以及2,3,4,6号位脱乙酰基等六步反应的技术路线。并利用熔点测定仪、傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)以及核磁共振波谱仪(NMR)对每一步的合成产物进行表征分析。银杏是一种非常有代表性的裸子植物,本研究聚焦于银杏中纤维素-木素复合体结构的分析。将带2H同位素标记的UDP-葡萄糖-6-D2、带13C标记的木素前驱物—coniferin-13Cα以及4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)抑制剂—3,4-亚甲二氧基肉桂酸投入到五年生的银杏植物体内,对培养结束后银杏形成层组织的显微镜观察发现形成层组织较宽,说明银杏的生长状况良好。对银杏新生木质部的13C同位素以及2H同位素的丰度进行检测分析,发现在银杏的新生木质部中13C同位素丰度以及2H同位素的丰度都有明显增高,说明带6-2H2标记的纤维素前驱物以及带α-13C标记的木素前驱物在新生木质部都被高效代谢而沉积,同时也得出木素前驱物与纤维素前驱物在细胞壁上的代谢转化规律,木素与纤维素的沉积过程都是从初生壁和胞间层开始,其次是在次生壁。利用CP/MAS 13C-NMR对银杏的新生木质部组织进行检测,并且做差谱分析,发现带13C标记的银杏新生木质部中木素α位的信号明显增强,说明木素前驱物转化为了木素分子,并且木素结构单元之间的构型有β-5,β-O-4和β-1,木素跟碳水化合物形成的共价结合有α-醚键和α-缩醛键。采用Bj(?)rkman的方法提取银杏6-2H/α-13C双同位素标记的木素-碳水化合物复合体(lignin-carbohydrate complexes,简称LCC)和磨木木素(milled wood lignin,简称MWL)。使用等量的纤维素酶以及半纤维素酶配置的混合液对6-2H/α-13C双同位素标记的LCC进行水解得到了酶解LCC(enzymatic degraded LCC,简称EDLCC)。采用FT-IR对银杏LCC、MWL以及EDLCC分别进行检测分析,发现了典型的银杏LCC结构、MWL结构以及EDLCC结构的吸收峰。采用13C-NMR对MWL进行表征,木素结构单元之间的结合形式有β-O-4、β-5、β-1以及β-β构型。通过对6-2H/α-13C标记的银杏LCC作1H-NMR差谱的分析可知,在银杏植物体内,纤维素跟木素的间的结合类型有苯甲醚键结合以及酯键连结合。并且银杏EDLCC的1H-NMR差谱出现葡萄糖的信号峰进一步证实了纤维素与木素的连接。纤维素糖环中6位上碳原子与木素侧链上的Cα形成苯甲醚键结合,此外,木素结构中的阿魏酸以及对香豆酸的侧链γ位碳原子与纤维素6号位上的碳原子形成的酯键结合。对银杏形成层组织的进行了组织培养,投入带标记的木素前驱物—coniferin-13Cα,通过CP/MAS 13C-NMR分析发现,投入带13Cα标记的木素前驱物的形成层组织对比投入不带标记木素前驱物的形成层组织,多个与Cα相关的信号峰都有明显增强。通过作差示谱图分析,证实了木素结构单元之间的结合形式有β-O-4、β-5、β-1以及β-β等构型,而木素主要以侧链上的Cα同碳水化合物构成缩醛键结合、苯甲酯键结合以及苯甲醚键结合。
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