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目的本研究旨在阐明NEDD4在EGFR信号通路介导的肺癌细胞迁移中的作用,明确NEDD4在该过程中的具体调控机制,为探讨肺癌发生发展及其分子靶向治疗提供理论基础和数据支持。方法1、利用慢病毒表达系统NEDD4 sh RNA敲低肺癌细胞株A549和H1650的内源性NEDD4,并用western blotting检测敲低效果;在A549 sh NEDD4细胞中利用慢病毒表达系统转入抗NEDD4 sh RNA的NEDD4基因,以恢复NEDD4在A549细胞中的表达。2、通过wound healing实验和transwell迁移实验来检测敲低NEDD4以后,对依赖EGFR信号通路或基础的肺癌细胞迁移的影响。3、采用EGF处理A549和H358细胞0-4h,激活EGFR信号通路,通过免疫共沉淀实验检测NEDD4与活化的EGFR之间的相互作用。将63个肺腺癌组织样本制成组织芯片,通过免疫组织化学染色方法检测NEDD4与EGFR在肺腺癌组织中的表达情况,并统计分析二者在肺腺癌组织中的共表达情况。4、通过GST-UBA pull down方法检测NEDD4能否通过泛素化下调PTEN水平;并用免疫组织化学染色方法检测在肺腺癌组织中NEDD4与PTEN的表达及亚细胞定位。5、使用慢病毒表达系统在A549细胞中稳定过表达NEDD4或NEDD4失活突变体(NEDD4-LD,即NEDD4-C867A),经EGF处理30min后观察在细胞边缘处出现的LAMP2阳性囊泡的情况并进行定量计数。收集A549载体对照组和A549 sh NEDD4组的培养基,通过ELISA方法测定细胞分泌到培养基中的组织蛋白酶B的量。6、使用特异性组织蛋白酶B的抑制剂CA-074Me处理A549细胞,并通过wound healing和transwell迁移实验,评估组织蛋白酶B在EGFR依赖性肺癌细胞迁移或基础肺癌细胞迁移中的作用。结果1、A549细胞中稳定敲低NEDD4显著降低了EGF诱导以及基础的细胞迁移,而重新表达NEDD4能够恢复细胞迁移能力;同样,在EGFR酪氨酸激酶缺失突变的H1650细胞中稳定敲低NEDD4也可显著抑制EGF刺激的细胞迁移。2、EGF激活EGFR信号后,EGFR发生磷酸化并发生配体诱导的胞内降解,免疫共沉淀实验结果表明,EGF刺激后NEDD4特异性的与EGFR复合物相互作用。3、免疫荧光结果显示,无EGF刺激时,EGFR主要定位于肺癌细胞A549细胞膜上,而NEDD4定位于细胞质,二者无共定位。当使用EGF刺激细胞60min后,EGFR内吞进入细胞质,继而与胞质中的NEDD4共定位。63例临床肺腺癌组织样本中,NEDD4和EGFR在41个样本中过表达,二者过表达率均为65%,且NEDD4和EGFR总是在肺腺癌组织中共表达。4、NEDD4不能泛素化PTEN使其降解;NEDD4与PTEN在肺腺癌组织中的表达并非负相关。5、使用溶酶体抑制剂氯喹处理A549细胞后可以显著抑制EGF依赖性的肺癌细胞迁移。6、野生型NEDD4过表达细胞中,EGF刺激30min后在细胞边缘出现大量LAMP2阳性囊泡;而在NEDD4失活突变体过表达的细胞中没有观察到LAMP2阳性囊泡结构。7、在A549载体对照细胞中,EGF显著刺激组织蛋白酶B的分泌;而在NEDD4敲低的细胞株中,组织蛋白酶B的基础分泌量下降50%,并且EGF刺激对NEDD4敲低细胞分泌组织蛋白酶B无影响。8、使用10u M CA-074Me特异性抑制组织蛋白酶B可以显著抑制基础以及EGF刺激的肺癌细胞迁移。结论1、稳定敲低NEDD4显著抑制肺癌细胞中依赖或不依赖EGFR信号通路的细胞迁移。2、NEDD4通过与EGFR信号通路相互作用来参与调节肺癌细胞迁移,并且该过程不依赖于PTEN/PI3K/AKT通路。3、NEDD4通过其连接酶活性促进溶酶体分泌组织蛋白酶B。4、组织蛋白酶B可以促进基础和EGF刺激的肺癌细胞迁移。