昆虫作为地球上最为繁盛的生物类群,能适应复杂多变的环境,具有强大的生存和繁衍能力。昆虫的觅食、求偶、交配、繁殖、防御、迁移等行为,均与其灵敏的嗅觉系统密切相关。因而,对昆虫嗅觉系统中重要嗅觉基因的功能研究,对理解昆虫的生存策略具有重要的研究意义。家蚕是重要的经济昆虫,也是鳞翅目模式昆虫。利用家蚕研究昆虫的嗅觉系统具有优势。分子层面,家蚕具有成熟的遗传操作体系,可通过显微操作,对相关嗅觉基因进行修饰。个体层面,家蚕是典型的寡食性昆虫,幼虫除桑叶外很少取食其他植物,且家蚕具有简单的性信息素系统。本论文以家蚕为研究对象,利用转基因CRISPR/Cas9技术对家蚕取食行为或成虫交配行为中重要的嗅觉基因进行突变,再利用化学生态学方法验证这些嗅觉基因的功能,为深入解析昆虫的嗅觉感受机制提供重要的参考。主要的研究工作及成果包括以下几个方面:1.家蚕嗅觉受体共受体Orco基因的功能研究。利用双系转基因CRISPR/Cas9技术,对家蚕Orco基因进行突变。通过向家蚕胚胎显微注射转基因质粒及荧光筛选,在G2代得到家蚕Orco突变体,再利用PCR扩增检测及自交筛选,在G5代获得稳定遗传的Orco纯合突变体品系。利用单感器记录(SSR)技术检测Orco纯合突变体家蚕触角嗅觉神经元对两种性信息素成分的电生理反应,发现Orco基因的缺失严重降低了嗅觉神经元的反应。分别以野生型雌性家蚕、蚕蛾醇、蚕蛾醛及按11:1比例混合的蚕蛾醇/蚕蛾醛复合物进行刺激家蚕,对Orco突变体和Orco纯合突变体成虫的交配行为进行测定,结果显示,Orco突变体表现出显著减少的交配行为,而Orco纯合突变体的交配行为消失。用桑叶或不同浓度的桑叶主要吸引性成分cis-jasmone对Orco突变体家蚕幼虫的取食行为进行测定,发现突变体对桑叶和不同浓度的cis-jasmone的选择能力显著下降。这些结果说明,Orco在家蚕的嗅觉系统对气味物质的感受过程中不可或缺,直接调控家蚕幼虫的取食行为和成虫的交配行为。2.家蚕嗅觉受体基因OR54和OR56的功能研究。利用转基因CRISPR/Cas9技术,对与家蚕幼虫取食相关的两个嗅觉受体基因OR54和OR56单独突变及同时突变,分别获得BmOR54、BmOR56和BmOR54-OR56三个突变体品系。测定三个突变体家蚕的取食行为,结果表明,与野生型家蚕相比,OR56突变体的取食行为增强,OR54突变体与OR54-OR56突变体的取食行为均降低。检测三个突变体内OR54和OR56的表达变化,发现OR56的降低引起OR54表达的下降,而OR54的降低引起OR56的表达下降。说明OR56具有促进取食的作用,OR54则有抑制取食的作用。以上结果说明,OR54和OR56两个相互拮抗的嗅觉受体基因共同调控家蚕幼虫的取食行为。3.家蚕性信息素结合蛋白PBPs的功能研究。利用转基因CRISPR/Cas9技术,分别得到家蚕BmPBP1、BmPBP1-PBP2和BmPBP1-PBP2-PBP3三个突变体品系。用两种性信息素成分蚕蛾醇和蚕蛾醛测定突变体家蚕的嗅觉神经元反应及交配行为。结果发现,PBP1突变体的嗅觉神经元对蚕蛾醇的反应比野生型更强烈,而PBP1-PBP2突变体的嗅觉神经元对蚕蛾醇的反应消失,说明当PBP1被突变时,PBP2蛋白会结合蚕蛾醇进行补偿。当用蚕蛾醛刺激时,PBP1突变体的交配行为反应增强,而PBP1-PBP2突变体的交配行为消失,说明PBP2蛋白结合蚕蛾醛。用野生型雌性家蚕、蚕蛾醇或11:1的蚕蛾醇/蚕蛾醛混合物刺激时,PBP1-PBP2突变体的交配行为反应增强,而PBP1-PBP2-PBP3突变体的交配行为反应降低,说明PBP3对PBP1、PBP2蛋白进行补偿。利用far-western结合质谱鉴定技术,发现PBP1突变体中与残存的PBP1蛋白相互作用的蛋白transaldolase。因为transaldolase可催化醇基基团和醛基基团进行互换,推测PBP1突变体内残存的PBP1蛋白可与transaldolase酶作用,使得进入感器内的蚕蛾醇分子转化为蚕蛾醛,由PBP2蛋白进行转运,从而对PBP1蛋白进行补偿。基于这个假设,提出了补偿效应可能发生的模型。