氧气的引入是生命进化史中一次重大的飞跃,除了厌氧生物外,几乎所有的生命物质都需要氧的参与来维持生命过程,同时降解体内的毒性。细胞色素P450酶是一类以血红素铁卟啉为辅基的单加氧酶,这类酶在自然界中广泛参与生物体内的氧化代谢,其代谢途径包括羟化作用、去烷基化、环氧化以及还原反应等。它不但能催化类固醇激素等内源性底物的代谢,而且对外源性药物分子的代谢、激活以及毒性降解等都起着重要的作用。由P450酶介导的药物代谢和药物之间的相互作用在临床药物治疗中极大地影响了药物安全以及药效。因此,了解P450酶如何识别、结合以及催化药物分子对药物设计非常重要。目前,对P450酶的研究已经发展到原子水平。利用分子动力学模拟手段从微观水平上精确地研究P450酶结构与功能之间的关系已经在科学界中发挥着越来越重要的作用。本文利用多种分子动力学模拟方法,对几类重要P450酶(CYPB1、 CYP2E1及CYP17A1)的结构和性质进行了深入系统地研究,主要内容包括六个章节。第一章为引言,介绍了酶的基础知识以及P450酶的结构特点和催化循环过程；第二章为理论基础与计算方法；第三章至第六章分述了对本文所选取的三种重要的P450酶所开展的系统理论研究。具体内容包括：1. CYP7B1底物选择性及门控机制的研究CYP7B1为CYP7亚家族酶的成员之一,广泛存在于大脑的海马体中,在肝脏及肾脏中也有表达。该酶在类固醇的失活过程中起到了重要的作用,并且与肝功能衰竭以及痉挛性截瘫类型5(SPG5)疾病息息相关。我们测得CYP7B1舌性口袋体积为826A3,推测其与底物结合时可能存在多种构象。由于实验研究中并未获得CYP7B1的结构信息,这使得对该酶的进一步研究受到了极大的阻碍。我们通过同源模建方法获得CYP7B1的三维结构模型,并将四种天然底物(25-HOChol, DHEA, enediol和anediol)与其对接进行分子动力学模拟,发现CYP7B1酶对于取代基不同的底物存在多种结合模式。同时,活性位点处的锚定氨基酸对于取代基不同的底物的贡献也略有差别,但W291和F478在四种底物结合中均有较大的贡献。此外,根据底物疏水程度的不同,底物对进出通道的选择也有所差别。在分子动力学模拟过程中,我们观测到两种底物的进出通道均存在不同程度的打开过程,调控各通道开合的“门控开关”为F111-H139与F223-F489。F489作为“桥梁”,通过调整侧链角度从而连接/阻隔活性口袋与path2通道。总体而言,此项研究进一步揭示了CYP7B1在原子水平上的相关结构特性和底物选择性,其新型小分子设计为未来CYP家族的药物设计等领域提供了可靠信息。2. CYP2E1对花生四烯酸的识别与结合研究CYP2E1因为拥有所有P450酶家族成员中最小的活性位点区域(182A3),但却可以代谢外源性小分子化合物以及内源性脂肪酸而备受科研工作者关注。其中,对外源性化合物醋氨酚的代谢中,在其过量的情况下可能会导致肝中毒甚至死亡。在对内源性脂肪酸如花生四烯酸的代谢中,可产生活性自由基,从而促进肝脏细胞氧化损伤。目前的实验研究中存在非常多的CYP2E1与外源性化合物结合的结构信息,但尚未有CYP2E1与花生四烯酸结合的结构信息的相关报道。研究工作者猜测,脂肪酸类底物进入CYP2E1的通道可能会与外源性小分子有所区别。为了探究其通道选择是否存在差异性,我们以常规分子动力学模拟为基础,结合随机加速动力学、拉伸动力学模拟以及分子对接、通道分析、结合自由能分析等方法对CYP2E1与花生四烯酸的结合模式及其结构特性进行了研究。并且,我们选取与花生四烯酸结构最为接近的ω-咪唑月桂酸的复合物晶体结构进行了比较分析。模拟结果明确了CYP2E1与脂肪酸结合后的最优占据通道,并提出调节通道开合状态的两个重要因素。结合自由能分析结果表明,花生四烯酸与脂肪酸类似物结合自由能的主要差异来源于极性相互作用,具体表现为可形成氢键数量的不同。通道分析以及随机加速动力学、拉伸动力学模拟结果表明,H107、A108以及H109通过氢键作用识别底物,并对稳定底物结合有较大贡献,因此,我们推测CYP2E1代谢脂肪酸底物主要经由2c通道进入CYP2E1的活性位点区域,而非外源性小分子配体进入的2a通道。该项工作从原子水平分析了CYP2E1酶与脂肪酸结合的结构特征,并给出了脂肪酸和药物分子进出蛋白通道选择的差异性的合理解释。3. CYP17A1突变体影响蛋白活性的分子机制CYP17A1(全称为细胞色素P450c17α同时具有17α-羟化酶和17,20-裂解酶的活性,是一类典型的膜结合双功能单氧酶,在类固醇激素合成过程中起关键作用。该酶是治疗前列腺癌和乳腺癌的重要靶标,可有效地抑制性激素的合成,从而控制癌细胞的转移。近年来,研究发现有超过50种CYP17A1酶的突变体存在,并且这些突变体可以使其介导的17α羟化酶和/或17,20裂解酶的活性下降或缺失。我们选择Y201N和E305G突变体作为研究对象,在常规动力学模拟的基础上,结合拉伸动力学模拟以及通道分析,对这两种突变体介导的酶活性缺陷的原因在原子层面上做出了解释。我们提出“通道机制”,从变构效应以及随时间演变的分子进出蛋白通道变化两个方面解释突变对蛋白催化效应的影响。两种突变体均未引发酶的整体结构改变,但存在局部构象变化的差异性。其中,Y201N突变体的F-G螺旋区域在动力学模拟过程中呈现出打开的构象,而E305G则呈现闭合的构象,其原因为疏水核心HC1的变化。随着构象的转变,两种突变体的主要通道均发生了不同程度的打开,从而降低了配体与酶的亲和力,在结合自由能分析以及拉伸动力学计算的平均力势中均可观测到结合能力的降低,从而在原子水平上解释了该蛋白催化效率降低的原因。4. CYP17A1与细胞膜结合的结构与功能的研究在真核生物中,P450酶通常与细胞膜结合。不同的P450酶相对于膜平面的倾斜角度有所区别,通常在38°到78°之间。一直以来,由于细胞膜的构建较为复杂,并且非常耗费计算资源,因此对于该酶系的研究通常处于溶剂环境下,而非细胞膜环境中。在我们之前的研究工作基础上,在本项研究中,引入细胞膜模型来模拟P450酶系在人体中的真实环境。我们利用全原子分子动力学模拟,对细胞膜与CYP17A1之间的相互作用进行了深入地研究,观测蛋白与膜自发结合过程中局部结构的构象变化,以及膜磷脂对亲脂性底物结合的贡献。模拟结果明确了CYP17A1与膜磷脂结合的深度和角度等结构特征,并探讨膜的存在对于底物进出蛋白通道的开合状况的影响。此外,在氢键及疏水相互作用分析中,表明CYP17A1与膜的结合存在特异相互作用,而非仅仅依靠简单的吸附作用。总体来说,该项工作阐述了CYP17A1酶在接近人体真实环境中的结构特征以及膜磷脂对于CYP17A1酶局部结构的影响,为今后有关细胞色素P450酶系生物膜模拟提供了可靠的理论线索。