膜转运蛋白在生物体中广泛存在,承担着物质运输、信息交换等一系列重要的生理活动。由于膜蛋白表达量低且难提纯,因此通过获得蛋白质晶体研究其功能成为一项难题。课题组前期通过分析大量转运蛋白结构特征发现,虽然有些蛋白序列一致性较低（10%左右）,但具有相似的核心区域。本论文以Halomonas sp.Y2中具有Na⁺,Li⁺转运功能的NhaD2转运蛋白与E.coli中具有Na⁺,K⁺,Ca²⁺转运功能的ChaA转运蛋白作为研究对象,初步建立了基于进化保守性分析、蛋白纯化、蛋白构像分析的离子转运蛋白研究方法,为分子转运机制的研究与蛋白模型的构建提供基础。本论文首先对NhaD2蛋白表达系统与表达条件进行系列优化,并通过Strep-tag II链霉亲和素-生物素系统初步蛋白纯化,SDS-PAGE与Western Blot定性与半定量分析,得到一株最优表达菌株p-nhaD2-linker-strep-pEASY-KNabc与最佳表达条件。纯化的NhaD2蛋白进行胰蛋白酶水解实验,结果表明在pH 8.0的条件下,NhaD2被水解成两条短带,一条大约25 kDa左右,另一条20 kDa左右。Cross-linking预实验中,三组半胱氨酸双突变菌株蛋白可正常表达,为后续实验提供基础。E.coli ChaA蛋白属于CaCA超家族,具有转运Na⁺,K⁺,Ca²⁺。通过对ChaA与CaCA家族中的已知结构蛋白进行多序列比对与进化保守性分析发现,它们具有极低的序列一致性（15%左右）,但具有相似的保守区域,因此猜测具有相似的核心区域与分子转运机制。在ChaA保守区域中选取16个保守性位点进行定点突变,并进行Na⁺与K⁺耐盐性实验。结果显示62,74,80,87,90,106,109,203,272,282突变体完全丧失Na⁺转运功能;62,73,74,85,87,90,282,300突变体完全丧失K⁺转运能力。综合分析以上结果,62,74,85,87,90,282突变体在Na⁺,K⁺转运过程中起着至关重要的作用。为进一步研究ChaA分子转运机制,对ChaA进行二级跨膜结构与三维结构预测,Swiss-model与Phyre结果均显示ChaA具有11个α螺旋;进一步分析三维结构发现,TMs 3-4,TMs 8-9位于ChaA蛋白结构的核心区域;TMs 3与TMs 8为不连续跨膜螺旋（TMs 3a,3b,3c,TMs 8a,8b）。突变分析获得的对Na⁺,K⁺转运具有重要影响的位点大部分位于保守跨膜区上（TMs 3）,E85位点位于核心区域形成的“X”结构附近,对离子转运起着至关重要的影响。为进一步对ChaA构象进行研究,首先获得一株表达菌株p-chaA-linker-strep-pEASY-KNabc,并通过Strep-tag II系统进行初步纯化,SDS-PAGE与Western Blot进行定性分析,并将目的条带进行质谱测定,结果表明在大约30 kDa的位置存在ChaA蛋白。由于蛋白纯度欠佳,后续实验将进行分子筛蛋白纯化,获得高纯度蛋白,为蛋白突变体构象变化研究做准备。