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背景胃癌作为消化系统常见的恶性肿瘤,发病率在各种癌症当中位居前列。藤黄中蕴藏着多种氧杂蒽酮类抗肿瘤活性物质,其中藤黄酸B（morellic acid,MA）具有潜在的抗胃癌的活性,其体内外抗胃癌的作用及作用机理值得深入的探讨。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,lncRNAs）作为细胞中重要的调控因子,与包括肿瘤在内的多种疾病有着密切的关系。lncRNAs能够作为caspase上游信号分子影响肿瘤细胞程序性死亡过程。因此,本研究首次尝试从lncRNAs调控caspase介导的肿瘤细胞凋亡及焦亡的角度探讨MA体内外抗胃癌作用的机制。目的观察MA对于胃癌的体内外的抗癌活性;以lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1信号通路促进胃癌细胞caspase-3依赖的凋亡和焦亡为切入点,探讨MA抗胃癌作用的分子机制。方法（1）MA提取分离纯化与含量测定乙醇超声提取、中压制备色谱分离及高压色谱纯化的方法对藤黄中MA进行分离;高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）法对MA进行含量测定及有机溶剂（甲醇,乙醇,二甲亚砜）中放置稳定性的考察。（2）MA抗胃癌活性及其诱导胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡体外研究。MTT实验观察梯度浓度的MA对不同胃癌细胞体外抑制作用;划痕实验观察胃癌细胞迁移。Annexin V-PI双染法检测胃癌细胞凋亡率;Western blot法测定胃癌细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bcl-2以及Bax的表达水平;荧光倒置显微镜观察胃癌细胞焦亡形态;乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测胃癌细胞LDH释放率;测定胃癌细胞焦亡相关蛋白GSDME N端肽段（GSDME N terminal,GSDME-NT）以及IL-18的蛋白表达水平。（3）MA抗胃癌活性及其诱导胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡体内研究。采用小鼠胃癌MFC细胞制备BALB/c小鼠胃癌皮下移植瘤模型,实验动物随机的分为:模型组（Model）,MA低剂量组（MA-L）,MA中剂量组（MA-M）,MA高剂量组（MA-H）和阳性药5-氟尿嘧啶组（5-FU）,另设正常对照组（Normal）;选择肿瘤体积、肿瘤重量、肿瘤抑制率、以及动物体重经时变化作为指标,观察MA对小鼠皮下移植瘤生长的影响;HE染色观察肿瘤病理形态的影响;免疫组化法测定MA胃组织中Ki67表达量。测定胃癌组织中凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bcl-2以及Bax的表达水平,焦亡相关蛋白GSDME-NT以及IL-18的蛋白表达水平,研究MA对体内胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的影响。（4）MA促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡的分子机制研究。RT-qRCR法测定不同浓度MA对胃癌细胞以及动物实验中各组动物胃癌组织中lncRNA GAS5的表达水平的影响。采用siRNA构建lncRNA GAS5低表达细胞,实验细胞分为:非靶序列siRNA对照组（NC-siRNA组）、非靶序列siRNA给药组（NC-siRNA+MA组）,lncRNA GAS5低表达对照组（GAS5-siRNA组）,lncRNA GAS5低表达给药组（GAS5-siRNA+MA组）。检测lncRNA GAS5低表达胃癌细胞的凋亡率、焦亡形态、LDH释放,检测lncRNA GAS5低表达胃癌细胞中lncRNA GAS5、miR-23a和Apaf-1mRNA水平以及cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、GSDME-NT、Apaf-1和IL-18蛋白表达。采用shRNA慢病毒包装构建lncRNA GAS5低表达细胞稳转细胞株,用得到的稳转株制备lncRNA GAS5低表达胃癌动物模型,实验动物分为:非靶序列shRNA对照组（NC-shRNA组）、非靶序列shRNA给药组（NC-shRNA+MA组）,lncRNA GAS5低表达对照组（GAS5-shRNA组）,观察MA对lncRNA GAS5低表达胃癌动物体内肿瘤生长的影响;测定lncRNA GAS5低表达胃癌组织中lncRNA GAS5、miR-23a和Apaf-1 mRNA水平以及cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、GSDMENT、Apaf-1和IL-18蛋白表达。结果（1）藤黄酸B提取分离与稳定性成功分离得到MA,经HPLC色谱峰的面积归一化方法测定及计算纯度为98.3%;MA在DMSO溶液中45 d内稳定性良好。（2）藤黄酸B在体外具有较强的抗胃癌活性,并能够诱导MKN-45以及MFC细胞发生caspase-3依赖的凋亡及焦亡。MA对于胃癌BGC-823,SGC-7901,HGC-27 MKN-45以及MFC细胞的IC50值分别为6.216±0.23μM,3.859±0.11μM,4.518±0.17μM,2.964±0.25μM和1.81±0.16μM。其中,对于MKN-45和MFC细胞的抑制活性最强。MA（1μM、2μM和4μM）处理组的胃癌细胞的迁移能力被显著的抑制（P<0.05或P<0.01）。MA（1μM、2μM和4μM）处理组胃癌细胞凋亡率显著升高,细胞中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和Bax的表达显著上调,Bcl-2的表达显著下调（P<0.05或P<0.01）。MA（1μM、2μM和4μM）处理胃癌细胞,均出现了明显的焦亡形态。MA（1μM、2μM和4μM）处理组胃癌细胞LDH释放率,显著增加,细胞中GSDME-NT以及IL-18表达显著上调（P<0.05或P<0.01）。（3）藤黄酸B具有体内抗胃癌活性,并能在体内诱导胃癌细胞发生caspase-3依赖凋亡及焦亡。在小鼠胃癌皮下移植瘤模型中,MA及阳性药5-FU对小鼠皮下肿瘤生长均有显著的抑制作用。疗程第15天,MA（1、2和4mg/kg）各剂量组以及阳性药5-FU（100mg/kg）对于小鼠体内肿瘤的抑制率分别为:79.32±7.69%,92.36±4.21%,92.18±2.99%和87.64±6.30%。肿瘤组织病理形态观察发现,模型组肿瘤组织中肿瘤细胞细胞核完整,细胞排列相对致密。MA（1、2和4mg/kg）各剂量组及阳性药5-FU（100mg/kg）组肿瘤组织中可见散在分布的凋亡以及坏死的肿瘤细胞,胞间出现裂隙,细胞核出现固缩和破裂的形态。MA（1、2和4mg/kg）各剂量组以及阳性药5-FU（100mg/kg）组动物肿瘤组织中的Ki67蛋白的表达量均显著降低,胃癌组织中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bax、GSDME-NT和IL-18的表达显著上调,Bcl-2的表达显著下调（P<0.05或P<0.01）。（4）MA通过调控lncRNA GAS5/miR-23a/Apaf-1通路促进胃癌细胞caspase-3依赖凋亡及焦亡。在体外,MA（1μM、2μM和4μM）处理的MKN-45细胞和MFC细胞中lncRNA GAS5的水平显著提高（P<0.05或P<0.01）。在小鼠皮下移植瘤模型中,MA（1、2和4mg/kg）各剂量组及阳性药组动物肿瘤组织中lncRNA GAS5水平均显著提高（P<0.05或P<0.01）。MA（2μM）组胃癌细胞凋亡率显著提高,细胞出现了显著的焦亡形态,LDH的释放率显著增加,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2μM）诱导胃癌细胞凋亡、焦亡及增加LDH释放率的作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2μM）组胃癌细胞中lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA水平显著上调,miR-23a水平显著下调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2μM）上调lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA以及下调miR-23a的作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2μM）组胃癌细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GSDME-NT、Apaf-1以及IL-18蛋白表达显著上调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2μM）对于这些蛋白水平的上调作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。在lncRNA GAS5低表达胃癌动物模型中,MA（2 mg/kg）组动物肿瘤体积和重量明显减小,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2 mg/kg）对于动物肿瘤生长的抑制作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2 mg/kg）组胃癌组织中lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA水平显著上调,miR-23a水平显著下调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2 mg/kg）上调lncRNA GAS5和Apaf-1 mRNA以及下调miR-23a的作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。MA（2 mg/kg）组胃癌组织中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GSDMENT、Apaf-1以及IL-18蛋白表达显著上调,敲低lncRNA GAS5水平后,MA（2mg/kg）对于这些蛋白水平的上调作用被部分逆转（P<0.05或P<0.01）。结论MA具有体内外抗胃癌的作用,其作用机制可能与其上调胃癌MKN-45及MFC细胞中lncRNA GAS5水平,靶向吸附miR-23a,拮抗miR-23a对Apaf-1的抑制作用,进而激活caspase-9及caspase-3,促进胃癌MKN-45及MFC细胞发生凋亡和焦亡相关。