近年来，随着高分辨质谱技术和相应生物信息学技术的迅速发展，蛋白质组学技术在系统性研究生理和疾病的发生发展的分子机制、药物的作用机制和靶标研究过程中取得了令人瞩目的成就。本论文就高分辨生物质谱及其在蛋白底物研究中的应用展开了研究，内容分为两部分:　　（一）基于最新四极杆-静电场轨道阱-线性离子阱三合一组合式超高分辨质谱技术的高效蛋白质组分析方法的建立和优化　　随着蛋白质组学研究的不断深入，高分辨质谱技术的快速发展在大规模蛋白质组分析及蛋白翻译后修饰的研究中发挥着越来越重要的作用。然而，分析时间过长及工作量过大严重阻碍了质谱在生物样本大规模蛋白质组深度分析中的应用。本文首先对最新的四极杆-静电场轨道阱-线性离子阱三合一组合式质谱Orbitrap Fusion进行了质谱参数的优化然后利用离线反相HPLC分离及质谱联用技术对HeLa全蛋白进行了深度分析。我们利用自制的10cmC18纳喷柱在一针样品中利用1h分析时间鉴定出多于5，000个蛋白，并且在10h的质谱运行时间内共鉴定出8，493个蛋白。本文为大规模生物样本的蛋白质组的鉴定和定量提供了一个快速有效的分析方法。更为重要的是，这一方法可以应用于生物标志物的发现。　　（二）基于质谱蛋白质组学方法的去泛素化酶USP14调控蛋白网络和底物研究　　研究表明，泛素化酶USP14有望成为治疗神经退行性疾病的新靶点。但是该酶在细胞蛋白网络中的作用及其底物蛋白还不甚了解。本课题利用基于细胞内稳定同位素标记技术(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)定量蛋白质组学研究方法研究了USP14的敲低(knockdown)对HeLa细胞整个蛋白网络的影响。该方法共定量了7，138个蛋白。其中397个上调蛋白，451个下调蛋白。生物信息学分析结果显示，上调蛋白显著性的富集在神经退行性疾病通路中，而下调蛋白主要集中在三羧酸循环的通路中，这提示了这些蛋白可能与能量代谢相关。然后利用蛋白免疫沉淀和质谱联用的方法鉴定出32个USP14潜在直接相互作用蛋白。这些研究对于了解USP14的调控蛋白网络的机理具有重要的学术价值和理论意义。