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结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis,Mtb）是引起结核病的病原体。随着多重耐药菌株和广泛耐药株的出现,结核病在全球范围内卷土重来,为全球第九大死因,严重威胁人类的健康。据统计,2016年全球有近1040万人感染结核病,130万结核病患者死亡,另有37.4万艾滋病患者因结核感染而死亡。结核分枝杆菌不产生内、外毒素,其毒力与其在宿主体内的大量繁殖、产生的代谢产物有关。铁离子在细菌呼吸和DNA合成中扮演着重要的角色,其利用率影响结核杆菌在人体内的感染能力。结核分枝杆菌利用分枝菌素作为铁载体牢固结合宿主内游离铁并运输至细菌内,这一过程对于结核分枝杆菌毒力非常重要。目前已发现14个分枝菌素合成酶,其中MbtB,MbtD,MbtE、MbtG和MbtK等对结核分枝杆菌的存活是不可缺少的。在结核分子杆菌中,Fe3+-羧基分枝菌素或是转运铁离子至分枝菌素关联的细胞壁上,或是递送铁离子至胞浆内膜的铁调控转运蛋白A和B。目前,结核分枝杆菌铁离子摄取、转运的调控机制还不完全清楚。sRNAs是一些可发挥调控作用的非编码RNAs,广泛存在于生命的各个领域。细菌sRNAs长度大约在50-500个核苷酸,可以通过多种形式调控基因的表达,在调控细菌适应性应答、代谢、毒力等多种重要生理过程中发挥重要的作用。细菌sRNA也参与铁摄取过程的调控,比如在许多革兰氏阴性菌中存在的sRNA ryhB,可以感受环境中铁离子的浓度,铁离子浓度下降会导致sRNA ryhB的表达,而ryh B促进转铁蛋白mRNA的降解,抑制转铁蛋白的表达,导致细菌对铁需要量的减少。前尚无研究sRNA参与调控结核分枝杆菌铁摄取、转运过程的相关报道。本研究旨在鉴定参与调控结核杆菌铁摄取的sRNA,并对其功能进行研究。本研究建立了一种结核分枝杆菌铁剥夺模型,并通过实时定量PCR检测铁剥夺条件下与铁代谢相关的关键基因,发现14个基因中有12个基因表达均显著上调,证明该模型能有效反应细菌对铁胁迫环境的应答。对标准株H37Rv在铁剥夺条件下的转录组进行高通量测序和分析发现,结核杆菌4008个基因中有755个差异表达基因,其中,基因表达量显著上调的有69个（fold-change≥2）,表达量明显下调的有40个（fold-change≥2）。GO富集分析发现,转铁载体活动度的生物过程基因、宿主铁聚集反应的分子功能基因、通过铁载体从宿主获取营养共生物的分子功能基因、铁离子引入的分子功能基因以及镍、钴离子反应的分子功能基因富集程度最高。通过对铁剥夺模型下结核杆菌RNA测序的结果进行分析,本研究预测出246个潜在的sRNA,命名为sRNA 001-246,并利用RNAplex软件对这些候选sRNA的靶基因进行了预测。GO富集分析发现,这些候选sRNA的靶基因主要集中在甘氨酸甜菜碱运送过程,KEGG分析发现,这些候选s RNA的靶基因富集在ATP结合盒转运体家族。差异表达的候选sRNA有4个,命名为ASssr,ASdapC,ncRv1354和ASnmtR。通过Northern印迹实验,发现ASssr真实存在,且在模型组和对照组中均有不同程度的表达;实时定量PCR结果证实ASdapC,ncRv1354和ASnmtR也是同样存在的,但表达量显著低于ASssr的表达量(210倍以上)。通过Rfam数据库比对发现,ASssr与ssr互补,ssr从结构上预测是tmRNA,tmRNA的主要功能是通过SmpB蛋白-tmRNA复合体介导的拯救机制释放绑定在mRNA上失去功能的核糖体,使之进入新的翻译循环;同时释放mRNA并降解异常的mRNA,以阻止核糖体的再熄火。因为仅存在于原核生物中,所以极有可能成为抗菌药物作用的新靶点。而预测ASnmtR的靶基因是nmtR,nmtR是结核分枝杆菌的一个镍/钴特异性抑制因子,调控介导细胞质镍/钴外排的细胞膜转运蛋白的转录,故ASnmtR有可能参与镍元素的外排。我们收集了7株临床分离的多重耐药结核分枝杆菌,并对候选sRNA的表达量进行了检测,发现ASssr、ASdapC和ASnmtR在卡那霉素耐药的结核分枝杆菌中表达量显著低于卡那霉素敏感的结核菌。我们推测ASssr、ASdapC和ASnmtR有可能参与卡那霉素耐药的过程,是卡那霉素耐药的潜在的分子标志物,这需要更多的临床样本进行验证。为了研究这4个候选sRNA表达量与缺铁环境严重程度的关系,本研究设计了三组不同程度的缺铁培养基。实时定量PCR检测发现,ASssr在严重缺铁培养环境下表达量显著上调,轻度缺铁环境虽上调但无显著差异;ncRv1354在缺铁环境下表达量即上调且具有显著差异;spearman相关性检验证实只有ASssr的表达量与缺铁程度呈高度正相关。我们收集了7株临床分离的多重耐药结核分枝杆菌,并对候选s RNA的表达量进行了检测,本研究通过比较以基因组和cDNA为模板的PCR结果,证实ASssr和上游基因Rv3098A共转录。为了研究Asssr的功能,我们构建ASssr的过表达菌株,命名为H37Rv-pMV261-ASssr。我们对过表达株的生长性状进行研究,在正常培养环境下,与对照组无差别;在缺铁环境下,对照组生长缓慢,过表达株对环境更敏感,基本不生长。我们采用实时定量PCR对ASssr过表达菌株的转录组进行了分析,发现包括14个铁代谢相关基因,21个预测的靶基因以及3个距离较远的无关基因的表达量均显著下调,表明ASssr过表达后基因表达量下调具有普遍性。通过最小抑菌浓度实验结果,我们发现链霉素、异烟肼、利福平对过表达株的最小抑菌浓度普遍降低,尤其是利福平的最小抑菌浓度下降了8倍。我们推测ASssr对结核分枝杆菌的基因表达具有普遍下调作用,降低了结核分枝杆菌对缺铁胁迫环境的耐受,增加了结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性,有可能成为治疗结核病尤其是针对多重耐药结核菌（MDR-TB）的作用靶点。