氧化石墨烯及其衍生物的抗菌机理研究

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与细菌造成的感染的抗争伴随着人类的历史。在抗生素诞生之后,细菌造成的感染得到了有效的控制,但是随着抗生素等的大量使用,细菌的耐药性越来越强,传统的抗菌剂越来越难以使细菌细胞失活。面对这种严峻的形式,新型的抗菌材料的开发迫在眉睫。与对应组分的宏观物质相比,纳米材料往往具有独特的理化性质,这使得它们在包括生物医药在内的很多领域得到了广泛的关注。氧化石墨烯(GO)是石墨在酸性条件下被氧化而形成的,是带有含氧官能团的石墨烯衍生物。GO的二维平面内含有环氧基、碳基和羟基,边缘含有羧基。与石墨烯相比,这些极性含氧官能团赋予GO良好的分散性。同时,大量的含氧官能团也使GO易于修饰。GO可以通过物理或化学作用与卤胺,金属纳米粒子,抗生素等形成复合的抗菌材料。研究人员认为GO可以通过复杂的多重物理化学作用破坏细菌细胞,它在生物医药领域有广阔的应用前景。但是GO的抗菌机理和抗菌性能还存在较大的争议,针对其抗菌性能和机理的研究具有现实意义。(1)通过Hummer法制备得到的GO。通过离心洗涤和透析除去氧化改性过程中引入的氧化剂、酸和盐,以排除残留的杂质对GO的抗菌性能的影响。利用拉曼光谱仪、傅里叶红外光谱仪(FT-IR)、X射线光电子能谱仪(XPS)和纳米粒度电位仪对GO的结构和元素组成进行表征。XPS的结果表明,制备得到GO的C:O比例为1.82:1,即通过氧化改性成功引入了大量含氧基团。同时S的相对丰度仅为0.3%,K的相对丰度在检出限度以下。这说明通过多次离心洗涤和透析,氧化改性过程中引入的氧化剂、酸和盐已被除去,制备得到的GO具有很高的纯度,排除了杂质对实验结果的干扰。同时Zeta电位的结果表明,GO在中性和偏酸性条件下均带强烈负电,它与细菌细胞之间的作用力为静电斥力。选用革兰氏阴性菌(大肠杆菌,E.coli)为实验菌种。抗菌实验的结果表明,在PBS溶液中GO在8μg/ml的低浓度下就可以使90%以上的大肠杆菌失活。活/死染色的结果表明,接触后细菌细胞的细胞膜结构被破坏,引发细胞内容物泄露导致细菌细胞死亡。FE-SEM的结果中可以观察的细菌细胞的细胞膜解体,与活/死染色的结果一致,同时,在FE-SEM中没有观察到细菌细胞与GO的直接接触作用。GO与菌体的作用过程中,在10μg/ml和5μg/ml的低浓度下可以分别使超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)失活。同时,8μg/ml的GO与细菌细胞接触后体系的ROS水平显著提升。这一协同的抗菌机理解释了GO在低浓度下良好的抗菌性能;同时也解释了活/死染色中,细菌细胞膜结构的破坏现象。生物相容性实验表明,在500μg/ml的浓度下,红细胞的溶血率为0。同时在1000μg/ml的高浓度下,人肾上皮细胞(293T)的存活率依然在75%以上。(2)通过真空热还原的方法在玻璃基体上制备得到了还原氧化石墨烯(rGO)膜层。这种制备方法避免了残留的还原剂对材料的抗菌性能的干扰。采用拉曼光谱仪、傅里叶红外光谱仪(FT-IR)、EDS能谱仪等对制备得到的rGO结构和元素组成分析。选用革兰氏阴性菌(大肠杆菌,E.coli)为实验菌种。抗菌实验的结果表明,将细菌细胞接种在rGO膜层表面,细菌细胞生长正常,rGO不具有抗菌性能。通过控制真空热还原时间,制备得到了一系列还原程度不同的rGO。采用拉曼光谱仪、傅里叶红外光谱仪(FT-IR)、EDS能谱仪等对制备得到的rGO进行结构和元素组成分析。选用革兰氏阴性菌(大肠杆菌,E.coli)为实验菌种。抗菌实验的结果表明,GO膜层可以使93.75%的大肠杆菌细胞失活,同时FE-SEM中可以观察到细菌细胞膜结构被破坏,细胞内容物泄露。与之相比,FE-SEM结果显示,与不同还原程度的rGO膜层共同培养后,细菌细胞均具有完整的结构,生长正常。研究发现,在经过真空热还原后,rGO与细菌细胞接触时无法提高ROS水平。同时,随着含氧基团的移除,rGO对CAT酶的抑制作用也在减弱。当热还原时间为12h,rGO对CAT酶的活性没有显著影响。生物相容性实验显示,不同还原程度的rGO均不会引起溶血现象,真空热还原制备得到的rGO具有良好的生物相容性。
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