第一部分ACR侧脑室注射对大鼠纹状体与小脑的毒性研究目的：以病理学改变为观测指标,采用侧脑室注射染毒方式,探讨ACR对纹状体与小脑MAPKs信号通路、Nrf2及NF-κB转录因子的影响。方法：35只成年雄性SD大鼠,体重200 g-220 g,随机分为5组,每组7只,即溶剂对照组(人工脑脊液,ACSF),6-羟基多巴胺(6-OHDA) (0.5mg/kg)阳性对照组和ACR低、中、高(0.5、2.5、12.5mg/kg)剂量组。侧脑室双侧注射后,观察动物一般行为改变。染毒24 h后处死动物,冰上立即分离纹状体与小脑,-80℃保存备用。尼氏染色观察纹状体与小脑神经元病理改变,免疫组织化学观察酪氨酸羟化酶阳性(TH+)细胞数,Western blot法检测TH蛋白表达,TUNEL法检测神经元凋亡,分光光度计法测定MDA水平,酶标法测定GSH含量,ELISA法测定TNF-α、IL-6水平,Western blot法检测MAPKs各蛋白表达,免疫荧光技术观察Nrf2与NF-κB转录因子表达。结果：(1)一般行为改变：染毒次日,高剂量及阳性对照组动物出现轻度步态紊乱现象。(2) Nissl染色：与溶剂对照组相比,中、高剂量及阳性对照组纹状体神经元与小脑蒲肯野细胞层尼氏体减少、细胞肿胀、排列疏松紊乱。(3)TH表达：与溶剂对照组比较,免疫组化结果显示高剂量及阳性对照组纹状体与小脑TH+细胞数均减少(P<0.05); Western blot结果表明ACR各剂量与阳性对照组纹状体TH蛋白水平均降低(P<0.01),高剂量与阳性对照组小脑TH蛋白表达亦减少(P<0.01)。(4)神经元凋亡：高剂量及阳性对照组纹状体与小脑TUNEL阳性细胞数目较溶剂对照组显著上升(P<0.05)。(5)氧化应激与炎性反应：与溶剂对照组相比,中剂量组纹状体与高剂量组小脑MDA含量显著升高(P<0.05); ACR各剂量及阳性对照组纹状体与小脑GSH含量显著降低(P<0.01)。与溶剂对照组相比,纹状体内TNF-a含量在高剂量与阳性对照组显著增加(P<0.05),IL-6仅在中剂量组明显升高(P<0.05)；小脑内TNF-a含量在高剂量组显著升高(P<0.05),IL-6含量在高剂量及阳性对照组显著上升(P<0.01)。(6) MAPKs信号通路：与溶剂对照组比较,小脑内高剂量组p-ERK1/2,阳性对照组p-JNK1/2,中、高剂量与阳性对照组p-p38蛋白表达均显著升高(P<0.05);纹状体内阳性对照组p-ERK1/2、高剂量组p-JNK1/2、中剂量组p-p38蛋白表达均显著增加(P<0.05)。(7)Nrf2转录因子：免疫荧光结果显示与溶剂对照组比较,高剂量与阳性对照组纹状体Nrf2表达显著上升(P<0.05);中、高剂量组小脑Nrf2表达亦显著增加(P<0.01)。(8) NF-κB转录因子：免疫荧光结果显示与溶剂对照组比较,中、高剂量及阳性对照组纹状体NF-κB表达均显著增加(P<0.05)；高剂量与阳性对照组小脑NF-κB表达显著升高(P<0.01)。结论：本研究建立ACR侧脑室注射神经毒性动物模型,发现0.5 mg/kg ACR侧脑室注射未引起纹状体与小脑神经元病理改变;2.5 mg/kg ACR侧脑室注射均可致纹状体与小脑神经元病理改变及多巴胺能神经元数目减少;12.5 mg/kg ACR染毒除引起上述改变外,还诱导纹状体与小脑神经元凋亡,大鼠出现轻微步态改变。此外,ACR可诱导纹状体与小脑氧化应激与细胞炎性因子水平增加,激活MAPKs信号通路,促进Nrf2及NF-κB转录因子表达增加。第二部分 ACR对PC12细胞的毒性作用及分子机制研究目的：以细胞活力、氧化应激及炎性反应作为观测指标,观察ACR对PC12细胞的毒性效应。通过特异性抑制剂与siRNA转染技术,探讨ACR细胞毒性中MAPKs、Nrf2与NF-κB信号通路的激活及三条通路之间的cross-talk,以此阐明ACR毒性作用的分子机制。方法：细胞染毒：0.6、1.25、2.5、5mmol/L ACR处理PC12细胞12h或24h。抑制剂或细胞转染：抑制剂(10μmol/L U0126、20μmol/L SP600125.10μmol/L SB202190、5μmol/L BAY 11-7082)分别预处理细胞2h或细胞转染(20 nmol/L control siRNA或Nrf2 siRNA) 4h后,2.5 mmol/L ACR再染毒24 h。MTT法检测细胞活力,相差显微镜观察细胞形态,DCFH-DA荧光探针法检测ROS生成,分光光度计测定MDA含量,酶标法测定GSH水平与GSH-Px活力,ELISA法检测细胞因子TNF-a、IL-6水平,免疫荧光检测Nrf2与NF-κB核转位,Western blot测定胞浆胞核Nrf2、keap1、HO-1、NQO-1蛋白表达,以及胞浆胞核NF-κB、 IκBa、TNF-a、COX-2蛋白表达,RT-PCR检测HO-1、NQO-1、TNF-a、IL-6的mRNA表达。结果：(1)细胞活力：与对照组相比,在不同剂量ACR暴露12h后细胞活力均未发生显著性改变。2.5、5 mmol/L ACR暴露24h可致细胞数目减少,神经突收缩,贴壁能力降低,胞体呈球状,且细胞活力显著降低(P<0.01),呈现较好的时间-剂量效应关系。(2)氧化应激与炎性反应：与对照组相比,2.5、5 mmol/L ACR组细胞ROS与MDA水平均显著增加(P<0.05), GSH含量在1.25、2.5、5 mmol/L ACR组显著降低(P<0.05); TNF-a含量及mRNA水平在2.5、5 mmol/L ACR作用后显著增加(P<0.05),IL-6含量及mRNA水平仅在5 mmol/L ACR作用下显著升高(P<0.01)。提示ACR可引起细胞氧化应激与炎性反应。(3) MAPKs信号通路：2.5、5 mmol/L ACR可使p-JNK1/2与p-p38蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05)。提示ACR可激活JNK与p38通路,且具有剂量效应关系。抑制剂试验表明,较2.5 mmol/L ACR组,MEK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB202190分别预处理均致Nrf2与NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.05),并减少Nrf2与NF-κB通路下游靶基因HO-1、NQO-1、 TNF-a的mRNA表达(P<0.05)。提示MAPKs通路阻断可抑制ACR诱导的Nrf2与NF-κB通路的活化。(4)Nrf2信号通路：免疫荧光结果表明ACR各剂量组Nrf2出现核转位现象,Western blot结果表明ACR各剂量组胞核Nrf2蛋白水平较对照组显著增加(P<0.01)；伴侣蛋白keapl蛋白表达较对照组在5 mmol/L ACR作用下显著升高(P<0.01)；Nrf2通路下游调控囚子HO-1蛋白水平在0.6、1.25.2.5 mmol/L ACR作用下较对照组显著上升(P<0.05), NQO-1蛋白表达在1.25、2.5、5 mmol/L ACR作用下较对照组亦显著增加(P<0.05)。提示ACR可诱导Nrf2信号通路的活化,且具有剂量效应关系。RNA干扰试验显示,与siRNA对照组比较,Nrf2 siRNA转染细胞内NF-κB蛋白水平显著降低(P<0.01)。提示Nrf2基因沉默可抑制ACR诱导的NF-κB转录因子活化。(5) NF-κB信号通路：免疫荧光结果显示2.5、5 mmol/L ACR组NF-κB出现核转位现象,Western blot结果显示胞核NF-κB蛋白表达在1.25、2.5、5 mmol/LACR处理后较对照组显著升高(P<0.05)；伴侣蛋白IκBa蛋白表达在0.6、1.25、2.5 mmol/L ACR作用下较对照组显著升高(P<0.05); NF-κB通路下游调控因子TNF-a、COX-2蛋白水平均在2.5、5 mmol/L ACR作用下较对照组显著上升(P<0.05)。提示ACR可活化NF-κB信号通路,且具有剂量效应关系。抑制剂试验表明,较2.5 mmol/L ACR组,NF-κB通路抑制剂BAY11-7082预处理可致Nrf2蛋白水平显著降低(P<0.01)。提示NF-κB通路阻断可抑制ACR诱导的Nrf2转录因子活化。结论：ACR在2.5、5 mmol/L剂量下作用24 h呈现出明显的细胞毒性,且具有剂量效应关系,表现为细胞活力降低、氧化应激及炎性反应发生。其可能涉及的分子机制包括ACR激活MAPKs信号通路(JNK、p38通路)：ACR促进keap1-Nrf2解离与核转位,促使靶基因HO-1、NQO-1蛋白表达增加;ACR引起IkBα-NF-κB解离与核转位,上调下游基因TNF-a、COX-2蛋白表达。在ACR细胞毒性中,MAPKs、Nrf2与NF-κB之间存在cross-talk,表现为MAPKs通路对Nrf2与NF-κB具有调控作用,而Nrf2与NF-κB之间存在双向调节效应。第三部分JNK与p38对ACR致PC12细胞凋亡的调控机制研究目的：以细胞凋亡为观测终点,探讨线粒体凋亡通路是否参与ACR诱导的PC12细胞凋亡。采用特异性阻断剂研究JNK与p38信号通路对线粒体介导凋亡的调控作用,为寻找ACR中毒的防治靶点提供理论依据。方法：细胞染毒：0.6、1.25、2.5、5mmol/L ACR处理细胞24 h。抑制剂：U0126、SP600125、SB202190分别预处理2h后,2.5mmol/L ACR再染毒24 h。Hoechst33258染色观察细胞凋亡,透射电镜观察细胞与线粒体超微结构,流式细胞术测定细胞凋亡率,JC-1染色检测线粒体膜电位改变,Western blot检测Bcl-2、Bax、细胞色素c、caspase-9与caspase-3蛋白表达。结果：(1)细胞凋亡：2.5、5 mmol/L ACR作用使DNA裂解,细胞核异染色体聚集；与对照组比较,2.5、5 mmol/L ACR处理可致细胞早期与晚期凋亡率均显著升高(P<0.05)。(2)线粒体膜电位与超微结构改变：与对照组比较,2.5、5 mmol/L ACR处理可致线粒体膜电位显著降低(P<0.01); 2.5 mmol/L ACR作用可使线粒体肿胀,甚至嵴断裂。(3)线粒体凋亡途径相关蛋白表达：与对照组相比,1.25、2.5、5 mmol/L ACR均可致Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05), Bax蛋白水平在2.5、5 mmol/L ACR作用下显著增加(P<0.05),细胞色素c蛋白表达在0.6、1.25、2.5 mmol/LACR作用下均显著升高(P<0.01)。(4) caspase级联反应：与对照组相比,2.5、5 mmol/LACR作用可致caspase-9, caspase-3酶原显著降低(P<0.05), caspase-9、caspase-3活化片段显著增加(P<0.01)。(5)JNK与p38通路对线粒体介导凋亡的调节：与ACR组相比,ACR+SP600125组Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05), Bax与细胞色素c蛋白水平降低(P<0.01),线粒体膜电位显著升高(P<0.01),细胞早期与晚期凋亡率均显著减少(P<0.05);较ACR组,ACR+SB202190组仅Bcl-2蛋白表达增加(P<0.05),且细胞早期凋亡减少(P<0.05)。提示JNK与p38通路阻断均可通过调节线粒体凋亡通路降低ACR诱导的PC12细胞凋亡,其中JNK通路阻断对ACR诱导的凋亡的抑制更明显。结论：ACR在2.5、5 mmol/L剂量下处理24 h可致PC12细胞线粒体超微结构异常及线粒体膜电位降低,启动线粒体凋亡通路,激活caspase级联反应,最终诱导细胞凋亡。JNK与p38对线粒体凋亡通路具有调节作用,抑制JNK与p38通路可降低ACR诱导的细胞凋亡。这为ACR中毒的防治提供了分子靶点。