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第一部分多发性骨髓瘤患者Treg表达水平及4-1BB信号在Treg中的免疫调控作用目的:(1)研究多发性骨髓瘤患者Treg的表达水平(2)探讨4-1BB信号对Treg细胞的促增殖作用。方法:(1)采用免疫荧光和流式细胞术检测多发性骨髓瘤患者外周血和骨髓Treg表达;(2)采用免疫磁珠法分选CD4+CD25+CD127low/-细胞,利用流式细胞术测定其表面4-1BB表达,同时加入IL-2后测定其4-1BB表达有无改变;(3)采用免疫磁珠法富集骨髓瘤原代细胞,与同源PBMC进行肿瘤淋巴细胞混合培养,CFSE法测定阻断4-1BB/4-1BBL信号通路后CD4+CD25high细胞的增殖改变结果:(1)多发性骨髓瘤患者外周血Treg水平较正常对照组高,多发性骨髓瘤患者的Treg水平与临床特征和预后无明显相关性;(2)Treg细胞表面构成性表达4-1BB分子,IL-2可上调Treg表面4-1BB表达,(3)原代骨髓瘤细胞表面高表达4-1BBL分子,通过4-1BB-FC交联4-1BBL阻断4-1BB活化信号能够抑制Treg增殖.结论:多发性骨髓瘤患者Treg细胞表达水平上调,Treg细胞表面构成性表达4-1BB分子,其介导的4-1BB正向信号可促进Treg细胞增殖,提示4-1BB信号可能为调节肿瘤微环境的干预靶点。第二部分同种异源Treg对肿瘤细胞直接效应的初步研究目的:探讨抗原特异性的Treg细胞对肿瘤细胞的直接效应方法:(1)分离正常供体单核细胞,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和重组白细胞介素(IL-4)诱导培养获得不成熟树突状细胞;(2)以负载肿瘤抗原的树突状细胞诱导抗原特异性Treg体外生成和扩增(3)把抗原特异性Treg与骨髓瘤细胞系进行体外共培养,采用Annexin-V/PI染色法测定骨髓瘤细胞凋亡水平有无改变,采用CFSE测定骨髓瘤细胞增殖是否受抑,采用细胞内因子染色法测定骨髓瘤细胞合成IL-6水平有无改变,(4)测定活化后CD95L在Treg表面有无上调.结果:(1)通过形态和表型特征鉴定证实培养所得不成熟树突状细胞;(2)采用树突状细胞能够诱导Treg体外扩增,7天后扩增效率达10倍(3)扩增所得抗原特异性Treg能够诱导肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖,细胞内因子染色提示抗原特异性Treg降低骨髓瘤细胞自分泌IL-6;(4)活化后Treg表面CD95L未上调表达结论:建立树突状细胞诱导抗原特异性Treg体外扩增模型,明确了抗原特异性Treg能够抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,其杀伤作用为CD95/CD95L非依赖性。