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WRKY转录因子是植物中最大转录因子家族之一,参与植物的抗病、发育调控以及非生物胁迫响应等重要生理活动。已有研究表明,WRKY转录因子与植物激素调控和次生代谢途径有关。我们实验室为了研究烟草打顶伤害与根系烟碱合成的关系,构建了烟草打顶前后SSH-c DNA文库,结合转录组分析,从中筛选到一个烟株打顶后与根系烟碱合成关键酶基因表达出负相关的转录因子基因——Nt WRKY-R1。前期的研究已经表明该转录因子具有整合JA和IAA信号途径的作用。本研究目的是为了进一步阐明该转录因子是否具有将打顶伤害诱导的JA和IAA长距离信号流整合后靶向调控烟碱生物合成这一生理过程的。研究结果如下:(1)分析了Nt WRKY-R1对烟株打顶、JA、IAA信号途径的响应并进行组织表达特异性分析。采用荧光定量PCR检测了打顶后在烟株打顶部位涂抹NAA,在不打顶烟株上部叶片上喷洒Me JA,烟株打顶前、后四个处理的烟株根系中Nt WRKY-R1,PMT,IAA13和PDF1.2表达量变化,结果显示:打顶后,PMT、IAA13和PDF1.2表达水平明显上升,而Nt WRKY-R1显著下降;而在打顶后涂抹NAA的处理中和不打顶喷洒Me JA的处理中,打顶对Nt WRKY-R1表达水平下降的影响得到缓解,但Nt WRKY-R1对NAA的响应强于Me JA;在这两个处理中PMT的表达水平相对于不打顶处理变化不大。表明烟株打顶触发了介导烟碱生物合成的JA和IAA信号途径。组织表达特异性分析显示,Nt WRKY-R1在根系中表达量较高。(2)从烟草根系克隆得到Nt WRKY-R1转录因子采用电子克隆结合RT-PCR方法,从烟草根尖组织克隆得到Nt WRKY-R1转录因子基因全长,对该基因进行生物信息学分析结果显示:该基因具有915bp ORF序列,153bp 5’-末端和311bp 3’-末端UTR。有一个高度保守的WRKYGQK基序,表明该基因属于WRKY基因家族。进化树分析显示属于IIe类WRKY亚家族。(3)Nt WRKY-R1激活结构域的分析采用酵母双杂技术分析显示,Nt WRKY-R1具有明显的自我激活功能。采用部分删除分析显示,该蛋白在N-端80氨基酸残基序列和C-端的75氨基酸残基序列都具有激活功能。(4)Nt WRKY-R1的互作蛋白分析利用酵母双杂交技术探寻Nt WRKY-R1的互作蛋白。共得到15个阳性克隆,测序结果在NCBI上进行核酸和蛋白质的序列对比,得出所筛选基因的相关信息并对其进行分组和归类。显示有40%的互作蛋白为肌动蛋白的结合蛋白(ADF)。ADF被认为是肌动蛋白细胞骨架重组的主要调节因子,参与各种细胞单元和发育活动以及响应生物与非生物胁迫的细胞信号中。