肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是能引起呼吸道感染的病原体,大约40%的社区获得性肺炎由此引起,易感人群为老人和婴幼儿,且近年来耐药菌株也逐年增加,严重危害人体健康。肺炎支原体培养产量低,给其研究带来了困难。目前尚未研发成功MP疫苗。疫苗研发工艺中,抗原的定量是疫苗研发瓶颈技术,同时,肺炎支原体的检测也依赖高质量的抗体。[目 的]获得特异性和高效性的抗MP单克隆抗体,为疫苗抗原定量和快速检测提供有力工具。[方 法]1、肺炎支原体培养方法的优化及其抗原纯化:将MP在体外大量培养,通过对培养基、培养条件、离心等工艺进行优化,获得纯度和蛋白量高的MP菌体。保存于-80℃冰箱备用。2、抗肺炎支原体特异性单克隆抗体杂交瘤株的筛选:将纯化后的抗原免疫Balb/C小鼠得到的脾细胞与SP2/0细胞融合,对培养上清呈阳性的杂交瘤细胞进行有限稀释,挑选单一、可以分泌高效性抗体的细胞株冻存。3、抗肺炎支原体特异性单克隆抗体的纯化及其鉴定:筛选出可以分泌特异性好、OD值高的杂交瘤细胞株,进行小鼠腹水培养。采用亲和层系纯化抗体;用SDS-PAGE电泳检测其纯度、BCA法测定其抗体浓度、与其他种支原体进行交叉反应检测其特异性、效价、抗体亚型、生长抑制试验(GI)和代谢抑制试验(MI)检测其对抗原的抑制程度,挑选出具有高特异性和高效价的单克隆抗体。4、肺炎支原体单克隆抗体在双抗体夹心ELISA法中的运用:采用兔抗MP多克隆抗体包被ELISA板,封闭后分别添加裂解和未裂解MP抗原,洗板后加入纯化的MP单抗,再添加羊抗鼠酶标抗体。采用棋盘试验优选出最佳抗体、酶标抗体稀释度,并进行交叉反应检测,并通过调整降低交叉反应,最后建立完善的双抗体夹心ELISA检测体系。[结 果]采用自制马血清大量培养MP,MP形态菌落未发生变化且产量较高。在离心力条件优化中发现,当采用3000 rpm和25000 rpm差速离心时,可获得杂质含量较低纯度较高的MP菌体。在制备单克隆抗体时,将抗原免疫三次后获得脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经过有限稀释多次筛选,共获得42株能够稳定分泌抗体的细胞株。经交叉反应得到9株无交叉反应的细胞株,抗体亚型为14B1、18F1、17A1为IgG2b,38A5、5B7 为 IgG1,14H1、14A5、14A1、18A2 为 IgG2a。抗体轻链均为 k 型。经过纯化,抗体纯度达标。经过效价检测以及生长代谢抑制试验选出4株效价较高的单克隆抗体。在双抗体夹心ELISA体系建立中,发现裂解后抗原抗体能够更好的结合。通过更换抗体、酶标稀释液,使交叉反应降低,在“S”型曲线中直线范围的R2可以达到0.98,可以运用于抗原定量。[结 论]1、优化肺炎支原体大量培养技术,可以降低成本获得大量MP;采用差速离心可以获得更高质量的MP抗原。肺炎支原体单克隆抗体制备中,成功筛选出9株高特异性抗体。2、经纯化鉴定,9株杂交瘤细胞均鉴定核实,且其中4株具有较高效价。3、利用得到的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA体系后,可以检测稀释128倍后的抗原含量。