【摘 要】
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目的:长段气管切除后重建是胸外科难以解决的问题之一。组织工程化气管具有生物相容性佳、获取便捷等许多优势,而被认为是解决长段气管切除后重建的最佳选择之一。而适当的横向及纵向弹性、一定的强度是气管替代物的必要属性。软骨细胞分泌软骨细胞外基质,维持基质与细胞间紧密联系,是维持气管形态和功能的重要组成部分。本项目尝试以探索不同方案构建更佳的软骨组织,并以体内肌瓣包裹培养法构建组织工程气管模型。本实验目的是
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目的:长段气管切除后重建是胸外科难以解决的问题之一。组织工程化气管具有生物相容性佳、获取便捷等许多优势,而被认为是解决长段气管切除后重建的最佳选择之一。而适当的横向及纵向弹性、一定的强度是气管替代物的必要属性。软骨细胞分泌软骨细胞外基质,维持基质与细胞间紧密联系,是维持气管形态和功能的重要组成部分。本项目尝试以探索不同方案构建更佳的软骨组织,并以体内肌瓣包裹培养法构建组织工程气管模型。本实验目的是以酶消化或组织块培养法分离得到兔肋软骨细胞并扩增,种植于PLGA或涤纶支架上培养,观察单层培养扩增中软骨细胞的形态、结构,及在支架上培养时的细胞生长状态、外分泌基质,探索分离培养软骨细胞的最佳方法。分离培养骨髓间充质干细胞,并定向诱导分化为软骨细胞。将不同种子细胞应用方案构建的软骨组织进行组织学比较,为构建组织工程软骨组织确定较为优化的种子细胞应用策略。并拟改进组织工程气管:1.组织工程气管结构先于体外培养2周,再植入体内,以减轻炎症反应,2.支架结构种植于靠近气管的肌瓣内,进行带蒂肌瓣的包裹培养,培养时间为4周,以促进软骨成熟和血管网形成。建立兔气管缺损,以组织工程气管替代,检测移植物功能和长期替代效果。内容:1.改良软骨细胞分离、培养方案及体外支架种植培养方法:将取出的兔肋软骨切成组织片,经胰酶、蛋白酶消化或酶处理后贴壁,分离肋软骨细胞并扩增。传代二次后种植于PLGA或涤纶支架,继续体外环境下培养。观察单层培养扩增中软骨细胞的形态、结构,及在支架上培养时的细胞生长状态、外分泌基质。结果:酶消化法和组织块培养法获得细胞为的原代肋软骨细胞,单次传代时间为5天。但组织块法分离细胞较慢,且出现一例成纤维细胞污染。软骨细胞种植于支架后贴附良好,二周时见基质分泌,三周后开始衰亡。2.优化肋软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养方案构建组织工程气管软骨方法:分离扩增二月龄新西兰兔肋软骨细胞和骨髓间充质干细胞,将其各自或以5:5及1:9的比例均匀混合,并种植于PLGA支架,于体外和体内培养后进行组织学检测。结果:单纯软骨细胞、软骨细胞与骨髓间充质干细胞（5:5）混合共培养均可以在体外、体内构建软骨组织。软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养（5:5）未出现成骨现象,而且相较单纯软骨细胞构建的弹性软骨其弹性纤维更密集、均质。3.带蒂原位肌瓣包裹法构建组织工程气管方法:以带蒂肌瓣包裹法构建组织工程气管,替代兔1.5cm长段气管缺损,检测移植物功能和长期替代效果。结果:肌瓣包裹培养能构建更符合生理结构的软骨组织,能构建更佳的新生血管,利于气管替代后上皮组织形成。结论:1.酶消化法及组织块法都可用于肋软骨细胞分离,酶消化法适合用于肋软骨细胞分离;2.获得的细胞经传代二次后种植于三维PLGA或涤纶支架,培养二周后获得了软骨-支架模型,可用于构建组织工程化气管;3.软骨细胞与骨髓间充质干细胞（5:5）混合共培养构建的软骨组织具有类似气管软骨组织的组织学特性,可以尝试用于构建组织工程气管中的软骨组织。4.体内肌瓣包裹培养可以形成更好的血管网和血供;5.良好的血供有助于上皮组织形成,助于维持软骨组织结构及功能;6.体内肌瓣包裹培养构建组织工程气管,在免疫正常的动物体内进行节段性气管替代,试验组动物存活状态满意,该方法适用于构建组织工程气管。
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