【摘 要】
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实验目的:本实验拟在体外水平研究是否可以通过改变T细胞内Sema4c的表达,从而调控p38MAPK信号通路的活化,进而影响T细胞增殖和分泌细胞因子等功能,最终实现对共培养的卵巢癌细胞造成生物学特征的影响。从中探索出卵巢癌改造免疫微环境的新机制,并初步阐明Sema4C在卵巢癌T细胞免疫中的作用机制,为寻找卵巢癌免疫疗法的新治疗靶点奠定基础。实验方法:1.构建人Sema4C基因慢病毒过表达载体和RNA
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实验目的:本实验拟在体外水平研究是否可以通过改变T细胞内Sema4c的表达,从而调控p38MAPK信号通路的活化,进而影响T细胞增殖和分泌细胞因子等功能,最终实现对共培养的卵巢癌细胞造成生物学特征的影响。从中探索出卵巢癌改造免疫微环境的新机制,并初步阐明Sema4C在卵巢癌T细胞免疫中的作用机制,为寻找卵巢癌免疫疗法的新治疗靶点奠定基础。实验方法:1.构建人Sema4C基因慢病毒过表达载体和RNAi慢病毒干扰载体,命名为OP-Sema4C和si-Sema4C。将慢病毒OP-Sema4C和si-Sema4C分别转染Jurkat细胞,获得Jurkat-OP-Sema4C细胞和Jurkat-siSema4C细胞。荧光定量PCR验证慢病毒转染的Jurkat细胞中Sema4C基因的过表达和沉默效果。2.添加p38MAPK通路抑制剂SB203580阻断过表达慢病毒转染的Jurkat细胞中p38MAPK通路后;为了检测不同分组的Jurkat细胞中p38MAPK信号通路相关分子在基因水平和蛋白水平表达情况,在这里我们将通过荧光定量PCR和Western blot等实验方法进行研究分析。3.应用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞术检测Sema4C对Jurkat细胞增殖、凋亡能力的影响;ELISA实验测定IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α等细胞因子表达情况。4.卵巢癌细胞SKOV3与慢病毒转染的Jurkat细胞共培养,建立SKOV3/Jurkat共培养体系;通过CCK-8、克隆形成实验、Transwell测定法、划痕愈合实验检测共培养体系中卵巢癌细胞SKOV3增殖、凋亡、侵袭、迁移等能力的变化。5.通过Western blot检测共培养体系中卵巢癌细胞SKOV3上皮间充质转化（EMT）相关蛋白的表达水平。实验结果:1.体外成功构建Sema4C过表达和敲低的Jurkat细胞株,并命名为Jurkat-OP-Sema4C细胞和Jurkat-si-Sema4C细胞。2.体外过表达Sema4C增强了Jurkat细胞增殖能力,降低细胞凋亡水平,同时促进细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-13的表达,抑制细胞因子IL-4、IL-10的表达。反之敲低Sema4C的Jurkat细胞则有着与其截然相反的实验结果。3.过表达Sema4C通过激活p38MAPK信号通路增强Jurkat细胞增殖能力,添加通路抑制剂后对这一现象存在抑制作用。4.构建T细胞与卵巢癌细胞共培养体系,过表达Sema4C的Jurkat细胞促进了卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化等细胞生物学特性。通过添加通路抑制剂或者替换为敲低Sema4C的Jurkat细胞共培养,则有效逆转了这一系列的细胞生物学特性。实验结论:Sema4C通过激活p38-MAPK信号通路,促进了Jurkat细胞增殖、细胞因子分泌等功能。而在T细胞和卵巢癌细胞的共培养体系中,通过调控Sema4c在Jurkat细胞中的表达情况,明显影响了卵巢癌细胞SKOV3增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化等生物学特性。
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