论文部分内容阅读
传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起鸡的急性、高度接触性传染病,主要侵害鸡的中枢免疫器官—法氏囊,是危害世界养禽业的主要传染病之一。该病毒导致免疫抑制,造成对其他疫病的易感性增强和降低对其它疫苗的反应性。近年来,IBDV在分子水平对IBDV的免疫机理、致病机制、病毒分子的结构与功能方面取得很大的进展但是仍有有待于进一步研究,特别是变异株、vvIBDV的出现,抗原的变异和多样性血清亚型,使本病在临床上诊断困难,对养鸡业造成严重损失。IBDV为双RNA病毒科禽双RNA病毒属,利用当地分离的变异株或选用抗原性与当地变异株接近的疫苗株制成灭活苗或弱毒苗,以及利用多种毒株联合制成多价疫苗可以使鸡群得到很好的免疫保护。我们在实施国家自然基金重大项目过程中,感染vvIBDV GX8/99株的鸡的发病率和死亡率比较高,鸡场出现免疫失败的现象频繁发生。本课题拟以vvIBDV GX8/99株为研究对象,将vvIBDV GX8/99株进行传代,研究从原始毒(鸡源毒)→鸡胚毒→细胞适应毒→细胞克隆化毒→克隆化毒株的细胞传代至30代的免疫原性的变化规律及其与核苷酸、氨基酸之间的关系。以便更好地掌握vvIBDV在整个传代致弱的过程中的免疫原性变化特点、vvIBDV“个体效应”的变化规律,为我国vvIBDV分子流行病学的研究及IBD的有效防治奠定基础,从而揭示超强毒的演变规律和毒力改变的分子基础,为解决超强毒毒力增强、超强毒能否致弱以及致弱过程中基因序列和核苷酸序列的变化,这种变化与病毒生物学特性的关系,弱毒株的生物学特性如何等急需解决的问题提供依据。第一部分vvIBDV GX8/99株病毒的克隆化及其传代培养本研究将vvIBDV GX8/99株首先在SPF鸡胚上传10代,然后在鸡胚成纤维细胞(CEF)上盲传22代,开始适应CEF,并引起细胞病变(CPE),表现为细胞聚缩,拉成纤丝状,最后变圆,脱落。再经无限稀释法进行2次病毒的克隆化,筛选得到了4株克隆化病毒。再将该4株克隆化病毒分别连续在CEF上传30代。通过免疫胶体金试纸膜检测各传代毒,除适应CEF之前的细胞毒检测不到IBDV外,其余各传代毒均可检测到IBDV。IBDV在细胞上增殖周期不定,CEF出现病变的时间有差异随着克隆化毒株传代代次的增加,CEF出现病变的时间也随之增加,本研究结果发现,超强毒GX8/99株从原代毒经过鸡胚、CEF,TCID50的变化规律:从原代毒经SPF鸡胚传10代,病毒在适应细胞的在增大,克隆化毒株经CEF传30代得到的克隆化病毒各传代毒,TCID50均降低。第二部分vvIBDV GX8/99克隆化毒株细胞致弱毒VP2高变区变异性分析vvIBDV GX8/99株克隆化细胞毒GX-IBDVE10C25CL1、GX-IBDVE10C25CL2、GX-IBDVE10C25CL4、GX-IBDVE10C25CL5通过鸡胚成纤维细胞进行致弱,分别选取四株克隆化毒株的5代、10代、15代、20代、25代、30代致弱毒株提取RNA,通过Nested-PCR、基因克隆、核苷酸序列测定和分析,摸索vvIBDV GX8/99株四株克隆株在细胞传代过程中VP2核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的变化规律。4个细胞适应毒克隆株在测序的VP2高变区的约145个氨基酸中,有12个位点发生了相同的变异,变得与适应细胞的疫苗毒D78株基本一致。氨基酸变异位点主要集中在222位(A→P)、242位(I→V)、248位(L→F)、253位(Q→H)、256位(I→V)、257位(Q→L)、270位(A→T或S)、279位(D→N)、284位(A→T)、294位(T→L)、299位(S→N)、330位(S→R)。实验进一步证明VP2高变区氨基酸的大部分变异与对细胞培养或组织的亲和性的关系更为密切,出现规律性的变异。270(A→T)与毒株的致病性以及免疫原性具有相关性,且位于七肽区的296位(S→R)与致弱毒株的致病力有关。第三部分vvIBDV GX8/99株4株克隆化毒F10、F20、F25、F30代免疫效果分析vvIBDV GX8/99株4株克隆化毒F10、F20、F25、F30代以10000TCID50免疫剂量对14日龄的雏鸡经口服首免,21日龄二免,记录死亡情况。所有免疫组于一免后3d、10d,二免后7d、14d、20d、30d,分别取30只实验组血清,进行抗体检测以及全血分析,并与40d龄经口服2000ELD50的vvIBDV GX8/99,结果表明10000TCID50免疫剂量对vvIBDV GX8/99克隆化毒株F20、F25均能提供的100%的保护,二免后第14d左右抗体浓度达到高峰。但是不同代次的免疫效果明显不同,结合实验二表明VP2高变区氨基酸的变异与致弱株的免疫原性关系不密切。一免后10d采取法氏囊组织观察病理组织学变化,四株克隆化毒株的F30代免疫鸡虽然造成极个别的法氏囊的损伤,但是这种损伤是可逆的,结合第二部分从免疫效果和病理组织学变化看,4株克隆化毒F30代中GX-IBDVE10C25CL4-30株免疫效果稳定,病理变化较轻,有望成为理想的疫苗株,为控制vvIBDV的感染提供一条新的途径。