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猪非典型瘟病毒(Atypical porcine pestivirus,APPV)是A-II型先天性震颤(Congenital tremor,CT)的主要病原体,主要引起新引进后备母猪所生产的第一窝仔猪震颤性疾病,临床症状表现为全身或者局部肌肉痉挛收缩并伴有共济失调。自2015年APPV首次在美国报道以来,迄今已经在全世界15个国家流行,给全球养猪业造成一定的经济损失。为研究APPV的遗传进化关系,本研究开展了中国部分地区APPV流行病学调查,进行了 APPV密码子使用模式分析。Npro是瘟病毒基因组翻译产生的第一个非结构蛋白,对病毒具有重要的生物学功能。该蛋白具有半胱氨酸蛋白酶活性,能够将其从翻译后的病毒多聚蛋白上自剪切出来,并进一步发挥病毒拮抗宿主天然免疫的作用。猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒在感染宿主后能抑制机体的天然免疫反应,从而导致病毒的免疫逃逸和持续性感染。已有研究表明,Npro蛋白在这方面起到重要作用。然而,APPV作为新发现的瘟病毒,其Npro蛋白是否具有自剪切活性有待确定。同时,APPV的致病和免疫抑制机理均不清楚,解析Npro蛋白在天然免疫方面的作用将有助于阐述这些问题。1 APPV的分离鉴定及序列分析为进一步了解APPV在中国的流行情况及其遗传关系,本试验使用RT-PCR技术对收集自中国部分地区的69份疑似感染APPV的组织病料进行病毒的检测,APPV阳性率为33%。将阳性组织病料进行病毒序列的扩增、测定及拼接,共得到4株APPV全长基因组序列,26株APPV部分基因组序列。对APPV在中国的地理分布情况进行统计发现,自2016年中国首次报道APPV以来,已经有12个省市及自治区相继报道了该病毒,表明APPV有全国流行的趋势。系统发育显示,现有的APPV毒株可以分为3个基因型,基因型1和2包括分离自中国的APPV毒株,基因型3可以分为多个亚型,包括分离自欧洲,北美洲及亚洲的毒株。其中,本试验扩增得到的APPV毒株均属于基因型3。本研究结果揭示了中国APPV流行毒株的多样性,更新了全球APPV流行毒株的基因分型,将为APPV的检测及防控提供重要的参考信息。2 APPV密码子使用模式分析密码子偏好性分析常用来了解不同病毒株间进化关系,从而明确它们之间的遗传特性。因此,为进一步了解APPV毒株之间的遗传演化关系,本研究使用生物信息学软件对可利用的APPV-ORF序列进行密码子使用模式分析。结果显示,主成分分析(PCA)结果与基于APPV-ORF序列构建的系统发育树结果基本一致。APPV-ORF为富含AU序列,其核苷酸使用存在偏好现象。有效密码子数(ENC)分析表明,APPV-ORF序列的密码子使用存在偏好现象,且偏好性较低。APPV-ORF的密码子使用模式受到二核苷酸丰度值、突变压力和自然选择因素的影响。其中,自然选择是最主要的因素。这些研究结果有利于进一步对APPV进化以及其在宿主中的适应性分析提供参考资料。3 APPV-Npro蛋白剪切活性的研究为了解APPV-Npro蛋白是否具有自剪切活性及影响其蛋白酶活性的关键氨基酸残基,本研究首先构建表达APPV Npro-C基因的野生型重组质粒及Npro基因的突变型重组质粒,随后转染HEK293T细胞,利用Western blot分析APPV-Npro蛋白的自剪切活性,并对与其蛋白酶活性相关的关键氨基酸残基进行鉴定。结果显示,APPV-Npro蛋白具有自剪切活性,可以在Cys180与Ser181之间进行自剪切;Cys180可以被中小分子质量的氨基酸替代,但Npro蛋白的剪切活性降低。His67,His69,Cys89是影响APPV-Npro蛋白剪切活性的关键氨基酸;N端前7个氨基酸对APPV-Npro蛋白的剪切活性是非必需的,而APPV-Npro蛋白其他序列的完整性对其剪切活性是必不可少的。本研究结果丰富了 APPV的病毒分子生物学信息。4 APPV-Npro蛋白通过IRF3抑制IFN-β的产生为研究APPV-Npro蛋白是否参与APPV对宿主的免疫调节过程,本研究首先检测APPV-Npra蛋白对INF-β的产生及其启动子活性的影响。随后,通过I型IFN信号通路中多种天然免疫基因刺激,探究APPV-Npro发挥拮抗作用的关键节点蛋白。最后,运用Co-IP、Western blot及间接免疫荧光等试验进行鉴定。结果表明,APPV-Npro可以抑制多种天然免疫分子激活的IRF3启动子活性,并且通过与IRF3发生特异性相互作用来抑制IFN-β的产生。APPV-Npro蛋白在病毒拮抗宿主产生IFN-β方面发挥重要作用,提示该蛋白与APPV的持续性感染有重要关联。