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目的:构建小鼠胚胎干细胞(Mouse Embryonic stem cells,mESCs)体外诱导分化胰岛素分泌细胞(Insulin producing cells,IPCs)模型,筛选miR-328作为重要差异表达miRNA的负向调控作用,验证miR-328抑制TGF-β2表达的分子机制及过表达miR-328对胰岛素分泌细胞控制糖尿病小鼠血糖水平的影响,为糖尿病干细胞治疗提供新的表观遗传学调控靶点。方法:(1)构建mESCs体外分化IPCs诱导模型,光镜观察分化各阶段细胞形态,免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测细胞Insulin及C-peptide表达,流式细胞技术(Flow cytometer,FCM)检测Insulin+细胞比例,实时定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测胰岛功能基因表达;(2)构建Agomir miR-328,转染多系前体细胞(Multilineage progenitor cells,MPCs),qRT-PCR检测 miR-328 过表达水平,培养至 21 天 qRT-PCR、FCM、酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunoserbent Assay,ELISA)及IF分别对比实验组、对照组胰岛相关基因表达、Insulin+细胞比例、葡萄糖刺激下胰岛素释放水平及细胞Insulin、Nkx6.1蛋白表达;(3)Agomir miR-328转染MPCs,测序筛选表达差异的mRNA,GO与KEGG分析差异基因的基因功能、富集通路,挑选表达下调基因,qRT-PCR验证mRNA水平;(4)构建siRNA TGF-β2及LVTGF-β2,生信分析预测miR-328与TGF-β2结合位点,双荧光素酶报告系统验证miR-328与TGF-β2 3’-UTR结合关系,蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测拮抗实验及回复实验TGF-β2蛋白水平,验证TGF-β2为miR-328下游靶基因;(5)siRNA TGF-β2转染MPCs,WB检测实验组与对照组TGF-β2蛋白表达差异,qRT-PCR检测胰岛发育早期关键基因mRNA表达差异,IF验证细胞内Pdx1蛋白表达差异;(6)经脾动脉持续灌注制备大鼠胰腺脱细胞支架,光镜观察胰腺脱细胞支架形态学改变,扫描电镜检测脱细胞支架超微结构,DNA含量、GAG含量检测脱细胞支架细胞残余与胶原保留情况,IF对比天然胰腺与脱细胞支架Collagen Ⅰ、Fibronectin、Laminin及Collagen Ⅱ蛋白含量;(7)链脲霉素(Streptozocin,STZ)构建1型糖尿病小鼠模型,大鼠胰腺脱细胞支架种植miR-328过表达及对照组IPCs,小鼠背部皮下移植监测过表达组、对照组及正常小鼠空腹尾静脉血糖,IF对比两组细胞Insulin、Somatostatin、Glucagon蛋白表达情况。结果:(1)诱导分化各阶段细胞具有不同光镜形态,分化末期约48.2%的细胞表达Insulin,IPCs与ESCs在胰岛相关功能基因表达上存在显著差别,IPCs共表达Insulin 与 C-peptide;(2)MPCs 转染 Agomir miR-328 培养至 21 天,miR-328 过表达后细胞胰岛相关功能基因及关键转录因子表示下调,Insulin+细胞由43.8%降低至18.3%,胰岛素释放量显著低于对照组、对不同浓度葡萄糖刺激反应无差异,Insulin+/Nkx6.1+细胞比例显著少于对照组;(3)测序结果显示AgmoirmiR-328转染MPCs后18个基因表达下降,65个基因上调,GO分析显示差异基因参与Cell Process、Metabolic Process、Single-organism Process 与 Developmental Process 等生物学过程,KEGG分析显示差异基因参与MAPK、TGF-β等干细胞分化相关通路,qRT-PCR证实干细胞分化相关基因TGF-β2、UNCX、Cphx2等表达变化与测序结果一致;(4)生信分析预测及双荧光素酶报告系统证实miR-328与TGF-β2 3’-UTR存在结合位点,WB证实过表达TGF-β2能够回复miR-328对其的抑制作用,敲降miR-328能够拮抗siRNA对TGF-β2表达的干扰;(5)siRNA TGF-β2转染MPCs,胰腺发育关键转录因子Pdx1蛋白水平下调,Pdx1+细胞生成显著减少,胰岛分化早期关键转录因子mRNA表达下调;(6)大鼠胰腺经脱细胞灌注后透明化,支架保留较完整超微网状结构,DNA定量、GAG含量证实支架符合脱细胞标准且保留较完整胶原,支架保留大部分Collagen Ⅰ、Fibronectin、Laminin 及 Collagen Ⅱ 蛋白;(7)STZ 糖尿病小鼠空腹血糖值稳定大于25mmol/L,与对照组相比AgomirmiR-328转染组细胞无法逆转小鼠高血糖症状,移植细胞Insulin、Somatostatin、Glucagon蛋白表达降低且细胞排列紊乱。结论:(1)mESCs经三步诱导法能够在体外稳定获取IPCs;(2)miR-328显著抑制IPCs体外分化效率及细胞功能;(3)miR-328通过靶向调控TGF-β2表达影响Pdx1+胰腺祖细胞形成,减少Insulin+细胞分化效率;(4)IPCs过表达miR-328后无法逆转STZ糖尿病小鼠高血糖症状,细胞Insulin、Somatostatin、Glucagon表达减少且无法形成紧密的胰岛状结构。