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胰腺癌是恶性程度最高的消化道肿瘤之一。尽管胰腺癌的诊断和治疗技术不断提高,但是病人的生存状况并没有明显的改善,这与胰腺癌发病隐匿,恶性程度高,发病时多伴有转移,发病机制复杂。而根本上,胰腺癌的发病机制是由于多个基因失调控而成。溴样结构域蛋白4(BRD4)是BET蛋白超家族的一员,其功能涉及基因组复制,转录,细胞周期的调控,以及促进肿瘤的进展等过程。已有的研究证实,BRD4参与了可以在脑胶质瘤、白血病、肝癌,淋巴瘤、恶性黑色素瘤,肝癌等恶性肿瘤的进展中起到重要的作用,抑制BRD4可以有效的降低某些癌基因的表达,但是其在胰腺癌中的作用还有待于进一步的阐述。在本研究中,为了阐述BRD4基因在胰腺癌中的功能,进行了以下五个部分的工作：比较胰腺癌细胞株和正常的胰腺导管上皮细胞之间BRD4的表达差异；构建BRD4基因干扰载体,并转染入胰腺癌细胞株PANC-1中MIAPaCa-2中,证实在细胞株中BRD4稳定沉默；研究BRD4沉默后对胰腺癌细胞系生长、增殖、侵袭、迁移等生物学特性的影响；探讨胰腺癌细胞BRD4沉默以后对吉西他滨化疗敏感性的影响；研究BRD4在胰腺癌中调控SHH信号通路。第一部分正常的胰腺导管上皮细胞与胰腺癌细胞株中BRD4的表达的差异目的：为了检测正常的胰腺导管上皮细胞与胰腺癌细胞株中BRD4的表达的差异方法：通过westernblot和实时定量PCR的方法检测胰腺癌细胞株COLO357, L3.6PL, SW1990, PANC-1, Capan-2和MIAPaCa-2和正常的胰腺导管上皮细胞株HPDE之间的BRD4表达差异。结果：通过westernblot实验证实在胰腺癌细胞株中BRD4蛋白的表达明显高于正常的胰腺导管上皮细胞株,同样,通过实时定量PCR的方法证实在胰腺癌中BRD4的mRNA的表达明显高于正常的胰腺导管上皮细胞株。在胰腺癌细胞株中BRD4表达最高的是PANC-1和MIAPaCa-2。结论：在胰腺癌中高表达的BRD4可能促进胰腺癌的进展。第二部分：建立稳定转染shBRD4的细胞系目的：构建BRD4基因的shRNA载体,转染细胞,并检测其效果。方法：首先设计针对BRD4不同位点特异性siRNA序列,合成寡核苷酸,然后将其连接到慢病毒Phblv-u6-puro载体上,琼脂糖电泳及测序鉴定。进行大肠杆菌转化,质粒大量抽提。获得的质粒,转染293T细胞进行病毒包装。最后用Phblv-u6-puro shBRD4感染胰腺癌细胞PANC-1和MIAPaCa-2,应用westernblot检测干扰效果。结果：本实验成功构建链接BRD4特异性siRNA序列慢病毒Phblv-u6-puro载体；然后转染Phblv-u6-puro shBRD4进入胰腺癌细胞系PANC-1和MIAPaCa-2,应用westernblot实验检测干扰效果,证明成功构建了稳定沉默BRD4的胰腺癌细胞株PANC-1和MIAPaCa-2。结论：成功构建Phblv-u6-puro shBRD4载体,获得稳定沉默BRD4的胰腺癌细胞株PANC-1和MIAPaCa-2。第三部分BRD4沉默后对胰腺癌细胞株生物学行为的影响目的：研究BRD4沉默后对胰腺癌细胞株细胞活性、增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。方法：胰腺癌细胞株稳定沉默BRD4后,通过CCK8、平板克隆实验、transwell小室侵袭和迁移实验、划痕实验、裸鼠体内成瘤实验等检验胰腺癌细胞系细胞活性、增殖、侵袭、迁移,体内肿瘤生长等生物学行为的变化。结果：通过CCK8实验证实,shBRD4PANC-1和shBRD4MIAPaCa-2的细胞活性较shcontrolPANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的细胞活性明显降低(P<0.05)。通过平板克隆实验证实,shBRD4PANC-1和shBRD4 MIAPaCa-2的增殖能力较shcontrolPANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的细胞增殖能力明显降低(P<0.05)。细胞划痕实验和transwell小室实验结果显示胰腺癌细胞株PANC-1、MIAPaCa-2在BRD4沉默后,胰腺癌细胞株shBRD4 PANC-1和shBRD4 MIAPaCa-2的迁移能力明显低于转染了shcontrol PANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的细胞株(P<0.05)。通过铺胶的transwell小室实验,证实胰腺癌细胞株 shBRD4 PANC-1和shBRD4 MIAPaCa-2的侵袭能力明显低于转染了shcontrol PANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的细胞株(P<0.05)。裸鼠成瘤实验检测BRD4基因沉默后细胞在裸鼠体内的成瘤能力。将裸鼠随机分成2组,分别皮下接种shBRD4PANC-1和shcontrol PANC-1胰腺癌细胞株后,每3天观察肿瘤的大小,共观察21天,结果发现shBRD4PANC-1组肿瘤的生长速度明显低于shcontrol PANC-1 (P<0.05)。21天后处死裸鼠,将肿瘤称重,shBRD4PANC-1组肿瘤的重量明显低于shcontrol PANC-1 (P<0.05)。通过免疫组化检查结果示shBRD4 PANC-1细胞系形成的肿瘤的Ki-67比shcontrol PANC-1细胞系形成的肿瘤的Ki-67值明显下降(P<0.05)。结论：BRD4沉默后对胰腺癌细胞株的生长、增殖、侵袭、迁移和裸鼠成瘤能力有着明显的抑制作用。第四部分：BRD4沉默后胰腺癌对吉西他滨的敏感性的影响目的：探讨BRD4沉默后胰腺癌细胞对吉西他滨化疗敏感性的作用。方法：应用实时定量PCR检测吉西他滨对胰腺癌细胞株BRD4的mRNA表达的影响。应用westernblot检测吉西他滨对胰腺癌细胞株BRD4的蛋白表达的影响。应用流式细胞仪检测BRD4沉默联合吉西他滨可对胰腺癌细胞株凋亡率的影响。结果：将胰腺癌细胞PANC-1、MIAPaCa-2分别接受吉西他滨(2umol/L)干预,实时定量PCR检测BRD4 mRNA表达水平,mRNA相对表达水平明显升高(P<0.05),差异具有统计学意义。westernblot检测BRD4蛋白表达水平,蛋白表达水平明显升高(P<0.05),差异具有统计学意义。流式细胞术检查结果显示,在胰腺癌细胞中当BRD4沉默后相对于对照组,其细胞凋亡率明显的增加,具有统计学意义(P<0.05)。而当BRD4沉默后联合吉西他滨治疗时,相对于对照组和BRD4沉默组,细胞的凋亡率明显的增加,具有统计学意义(P<0.05)。结论：BRD4沉默和吉西他滨具有协同治疗胰腺癌的作用。第五部分：胰腺癌细胞中BRD4调控SHH信号通路目的：为了揭示在胰腺癌细胞系中BRD4和SHH信号通路之间的关系方法：当BRD4沉默后,用westernblot检测SHH信号通路靶基因SHH, PTHC1,GLI1蛋白的表达,用实时定量PCR方法检测SHH信号通路靶基因SHH,PTHC1,GLI1的mRNA表达。结果：首先通过westemblot实验证实在PANC-1、MIAPaCa-2细胞株中BRD4沉默后,SHH信号通路的下游靶基因SHH, PTHC1, GLI1的蛋白表达明显的降低。接着通过实时定量PCR证实在PANC-1、MIAPaCa-2细胞株中BRD4沉默后,SHH信号通路的下游靶基因SHH, PTHC1, GLI1的mRNA表达明显的降低。为了进一步证实在胰腺癌中是可以经过非配体依赖途径调控SHH信号通路,我们将细胞株中加入hrSHH, westemblot实验证实在PANC-1、MIAPaCa-2 BRD4沉默细胞株中,SHH信号通路的下游靶基因PTHC1, GLI1的蛋白表达仍然明显的降低；实时定量PCR证实在PANC-1、MIAPaCa-2 BRD4沉默细胞株中,SHH信号通路的下游靶基因PTHC1, GLI1的mRNA表达仍然明显的降低。结论：在胰腺癌中,BRD4可以通过配体依赖和非配体依赖途径调控SHH信号通路。