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随着全球人口的急剧增加,在有限的土地上获得更多的粮食产量已经成为一个越来越重要的命题。作为促进粮食增产最主要因素之一,氮肥的大量施用在作物增产的同时,也给全球生态系统的稳定尤其是生物多样性带来的严重的问题。铵是一种重要的氮素存在形态,在植物氮同化过程中铵消耗的能量相对较小,同时在环境二氧化碳浓度较高的情况下铵比其他氮源更加适应植物生长,因此铵一直被视为相对优质的氮源。然而,当植物生长在仅有铵作为单一氮源的环境条件,或者生长介质铵浓度过高时,往往会表现出铵中毒现象。全球加剧的环境铵沉降以及农业生产大量叶面施肥使得植物铵毒害问题更加凸显,关于植物耐铵相关研究比以往任何时候都更加迫切。迄今为止,已经有八种生理生化机制被认为是导致植物铵毒害的原因。然而,更深层次的遗传和分子生物学机制的研究很少。这严重限制了植物耐铵机理研究的深入。因此,急需获得大量遗传背景清晰、前期基础研究深厚的遗传材料,挖掘植物调控耐铵性能的关键基因,揭示植物耐铵分子生物学机制。
本论文以模式植物拟南芥为研究材料,应用植物营养学、环境毒理学和分子生物学相关研究手段,开展了拟南芥铵响应突变体筛选、突变基因克隆及功能鉴定和分子机理探索等研究,取得如下主要结果:
首先,基于对6940个独立的T-DNA插入突变株系的筛选工作,最终确定四个新的铵响应突变体。其中三个表现为铵超敏感突变体,根据突变体铵处理下表型特征分别将其命名为“amosd”(ammonium overly sensitive with dead phenotype afterammonium treatment;“amosy”(ammonium overly sensitive withyellow shoots afterammonium treatment);“amos2”(ammonium overly sensitive mutant2)。另外一个突变体表现为对外源铵处理具有更高耐性,其命名为“amrl”(ammonium resistantmutant1)。
其次,进行了外源铵处理下突变体amosd超敏感特征相关分析。发现突变体amosd铵超敏感表型是由于突变体对培养基中外源添加的铵离子专一性超敏所致。进一步研究表明,突变体只有在地上部接触铵离子时才表现出超敏感表型。通过分析amosd和野生型Col-0回交后代突变表型,将amosd鉴定为一个单基因隐性可遗传突变体。
第三,通过图位克隆技术,最终确定突变位点,并通过将野生型基因在突变体中转基因实验,成功互补突变表型,从而明确了AMOSD基因编码一个控制线粒体RNA编辑的PPR蛋白。
最后,通过分析发现无论是在正常培养基中还是在铵处理条件下,突变体内源游离铵浓度和野生型相比没有任何差异,AMOSD基因突变并没有改变植株对铵的吸收代谢特性。同时发现,在铵处理下突变体内源ABA浓度不能像野生型一样迅速升高,而且实验观察范围内其峰值浓度也也显著降低。电子显微镜研究结果显示,AMOSD突变导致铵处理下植株细胞线粒体结构严重受损。
总结全文研究结果,本论文发现了一个由自主筛选获得的新的铵离子专一响应的隐性单基因可遗传铵超敏感突变体amosd;明确了AMOSD基因编码的线粒体PPR蛋白的突变进而导致植物内源ABA浓度变化调控功能的减弱和/或植物线粒体RNA编辑缺失,是最终导致植物对外源铵处理表现超敏感的原因;为阐明植物耐铵机制提供了新的切入点。