乳腺癌是产生于乳腺上皮组织的恶性肿瘤,是近年危害妇女健康最为常见的恶性肿瘤之一,发病率逐年上升,并且趋于年轻化。对于乳腺癌的治疗多采用手术治疗和化疗等,或多种方式联合治疗。在化疗药物研发过程中,大多数药物由于水溶性差导致其在体内难以吸收,生物利用度低。因此,纳米技术被用于改善药物化学性质及药代动力学性质,从而提高药物治疗效果。通过将难溶性药物制备为纳米混悬剂,以提高体内稳定性、增大药物在血液中的循环时间以实现药物在体内持续释放。纳米颗粒大小对药物溶解度、体内药代动力学、生物分布和药效学均有一定影响。静脉注射给药纳米粒一般粒径小于1 μm,但是粒径太小药物溶出速率过快,体内行为类似于溶液,导致在体内清除速率过快,粒径太大则被认为不适合进一步的纳米制剂开发,其不具备纳米制剂的优势,溶出速率过慢,快速聚集于网状内皮系统,易被单核巨噬细胞系统清除。目前,纳晶粒径大小对于药物在体内吸收、分布和药效研究较多,而纳米混悬剂粒径大小对药物体内命运的全面系统研究报道极少。因此,本课题拟制备不同粒径纳米混悬剂递送药物。选取白桦脂酸(Betulinic acid,BA)为模型药物,白桦脂酸为五环三萜类化合物,是天然的安全性较高的抗肿瘤药物,对乳腺癌、黑色素瘤和卵巢癌等多种癌症具有良好的治疗效果。但由于其存在水溶性差和体内血液循环时间短的问题,严重限制了临床应用。因此,制备不同粒径白桦脂酸纳米混悬剂(Betulinic acid nanosuspensions,BA/NSs)来提高BA的递送效率。为了最大化提高BA抗肿瘤疗效,将不同粒径BA/NSs联合Taxol(?)以达到预期的治疗乳腺癌效果。Taxol(?)为乳腺癌治疗一线药物,对于治疗乳腺癌有良好效果。但是由于制剂中加入有机溶剂聚氧乙烯蓖麻油(Criophore EL)容易导致过敏反应及肝肾毒性,严重限制了患者对Taxol(?)的用药依从性。而BA协同Taxol(?)不仅提高药物在肿瘤细胞内积累,还可以减弱Taxol(?)产生的过敏反应、肝肾毒性等,从而达到对乳腺癌增效减毒的作用。本课题采用高效绿色制备方法——高压均质法,以泊洛沙姆188和卵磷脂为助溶剂,通过改变均质压力和均质循环次数制备不同粒径BA/NSs。所得BA/NS(160 nm)、BA/NS(400 nm)和 BA/NS(700 nm)的粒径分别为 161.2±1.9 nm,406.5±17.1 nm,722.9±73.7 nm,粒径分布(PDI)均小于0.3,Zeta电位均小于-20 mV,冻干后再分散系数(RDI)均小于110%,表明其冻干前后的粒径无明显差异,且PDI及Zeta电位也变化不大。稀释稳定性和放置稳定性良好,透射电镜下观察到纳米混悬剂粒子分布均匀,均呈现长棒状形态,无粘连聚集现象。DSC和XRD结果显示所制备的不同粒径BA/NSs冻干粉制剂均为无定型状态,FTIR检测结果显示BA药物与各辅料之间没有发生化学反应,进一步说明制剂较稳定。体外释放实验结果显示,与BA原料药相比,制备为不同粒径的BA/NSs可以显著提高BA的释放速率,其中BA/NS(160 nm)中BA释放速率最快累积药物释放量最高,随着粒径增大BA/NSs中BA释放速率减小。体外细胞学研究考察了不同粒径BA/NSs联合Taxol(?)对小鼠乳腺癌4T1细胞的毒性和细胞凋亡的影响,进一步对不同粒径BA/NSs在细胞内摄取及摄取机制进行研究。不同粒径BA/NSs联合Taxol(?)对细胞毒性作用较BA游离药物强,4T1细胞对BA的摄取量随着BA/NSs粒径的减小而增大,其中BA/NS(160 nm)是通过网格蛋白介导的细胞内吞途径进入细胞,BA/NS(400 nm)以小窝蛋白介导的细胞内吞和巨胞饮两种途径进入细胞,最大粒径的BA/NS(700 nm)是以巨胞饮方式进入细胞,不同粒径BA/NSs以不同机制增加4T1细胞对BA的摄取,从而起到抗肿瘤作用。药动学实验考察了游离BA和三种不同粒径BA/NSs在大鼠体内药代动力学特性。BA/NS(160 nm),BA/NS(400 nm)和BA/NS(700 nm)各组的半衰期(T1/2)均有显著延长,AUC0-∞分别提高了 1.59倍、1.20倍和1.19倍。将BA制备为纳米混悬剂后,可以延长药物在大鼠体内的循环时间,并且表现出粒径越小药物累积量越高,和药物清除率越慢的特点,体内生物利用度显著提高。不同粒径BA/NSs在原位乳腺癌肿瘤小鼠体内药物分布研究表明:在肿瘤组织中,BA/NS(160 nm),BA/NS(400 nm)和BA/NS(700 nm)比 BA溶液蓄积量分别提高了 4.42倍,2.62倍和2.02倍,说明不同粒径BA/NSs可以提高药物进入肿瘤组织中,并且随着粒径的减小在肿瘤中累积量越多。并且不同粒径BA/NSs在肝和肾脏组织中蓄积量较其他组少,具有改善Taxol(?)所致的肝肾毒性作用。组织分布实验结果充分说明,纳米混悬剂可以通过减小粒径,不同粒径BA/NSs分别以不同的途径进入肿瘤细胞,提高药物在肿瘤组织中蓄积。建立4T1原位乳腺癌小鼠模型,对BA游离药物、Taxol(?)和不同制剂体内药效学进行研究,结果显示,游离BA和Taxol(?)体内抑瘤效果相对较弱,而不同制剂联合治疗在体内的抑瘤效果顺序为 BA/NS(160 nm)+Taxol(?)>BA/NS(400 nm)+Taxol(?)>BA/NS(700 nm)+Taxol(?)。此结果与体外细胞学评价结果一致。免疫组织化学研究结果表明,BA/NSs和Taxol(?)联用,可以通过抑制Bcl-2因子表达,增强Bax因子表达,诱导肿瘤细胞凋亡,与此同时,激活NF-κB信号通路,下调与肿瘤细胞迁移和侵袭相关基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)的表达,抑制肿瘤细胞的迁移。体外安全性评价表明Taxol(?)组易引发肝、肾急性炎症反应,毒性作用较严重。而BA/NSs联合Taxol(?)治疗对主要组织(心、肝、脾、肺、肾)没有明显损伤,无不良反应并且不会影响肝肾功能,无肝肾毒性作用,联合用药安全性较高。