非负矩阵分解(NMF)广泛应用于荧光成像的光谱分离，NMF将光谱混叠的荧光数据分解成一系列组分光谱以及每个光谱对应的空间分布丰度系数。然而在迭代过程中，NMF的解是非凸的，因而其分离的结果往往不是唯一的，通常依赖于算法初始值以及一些额外添加的限制条件(如稀疏性等)。对于荧光成像数据而言，自发荧光(AF)呈现弥散的空间分布，而目标荧光则通常在某些特定的组织附近聚集。基于目标荧光和自发荧光在光谱和空间分布上存在着明显的差异，我们提出一种新的初始方式，首先利用归一化割将全部的像素点分成两大类，一类属于目标荧光，另一类属于自发荧光。之后根据不同类的像素点的光谱信息，分别初始化目标荧光和自发荧光的光谱。在此基础上，根据空间分布上目标荧光的稀疏性和自发荧光的非稀疏性，部分稀疏限制引入到基于分层交替最小二乘的非负矩阵分解当中，只针对表示目标荧光的空间分布的丰度系数进行稀疏限制。通过归一化割的初始化和部分稀疏限制，在迭代过程中，目标荧光和自发荧光能够准确的分离。在仿真实验和活体的老鼠荧光实验，我们所提出的算法明显优于其他已知的算法。