木薯(Manihot esculenta Crantz)起源于南美洲,现普遍种植于热带和亚热带地区,木薯块茎根富含淀粉,在已知淀粉作物中淀粉含量最高,加上其对生长环境的高适应性,木薯已成为重要的经济和能源等多用途作物。随着木薯淀粉及其深加工业产品的需求量不断增加,木薯的产量无法适应市场的需求,因此选育优良的木薯品种显得尤为重要。利用多倍体育种进行木薯遗传改良,选育符合市场需求的新种质具有很大的潜力,特别是通过有性多倍化,促进不同的优良基因组间遗传物质重组,产生杂种优势,可加速对目标性状的筛选及对优良品种的选育。本研究以前期工作中得到的木薯有性四倍体(ST)及其母本华南5号、父本华南10号为主要供试材料,在确定木薯有性四倍体倍性纯合和稳定的基础上,对有性四倍体及其双亲的基本农艺性状、生理生化指标、抗逆性、块根亚显微结构和块根酒精发酵转化率等展开系统的比较分析,阐明了木薯有性四倍体产生的杂种优势,并结合转录组学等手段揭示了其中较显著杂种优势块根性状早熟和抗采后生理衰变的变异机理,为筛选木薯优良性状提供理论依据和研究方向。主要研究结果如下:1、采用流式细胞术和叶片染色体计数法测定了木薯有性四倍体的细胞DNA含量及染色体数,明确了其为纯合四倍体,且倍性具有稳定性。对田间种植的木薯有性四倍体及其双亲SC5/SC10生长发育不同时期的基本农艺性状进行了比较分析,连续测定三代无性繁殖系F1/F2/F3。结果显示:木薯有性多倍化后,农艺性状产生了一定的杂种优势。其株型产生巨大性效应,其株高、茎粗及地上部分鲜重在发育的各个时期都显著高于双亲,且无分枝现象。叶片相关指标也呈现巨大性特征,其叶型指数、叶面积、叶柄长在发育的各个时期都显著高于双亲;叶柄颜色变为紫红色,但叶片数量显著低于双亲。块根相关指标也发生了显著变化,其块根直径在发育的各个时期显著高于父本,与母本无显著性差异;块根长度与双亲无显著差异;块根鲜重在膨大期显著高于双亲;块根干物率在膨大期显著高于双亲,于成熟期略低于双亲;块根淀粉含量积累时期发生变化,表现为提早于双亲,缩短了块根的成熟期,于膨大期淀粉含量显著高于双亲,且直链/支链比与双亲差异较大,即淀粉成分发生改变。2、对木薯有性四倍体及其双亲成熟期植株进行叶片光合特性和叶绿素含量进行测定。结果显示:木薯有性四倍体叶片净光合速率、蒸腾速率、气孔导度以及水分利用率均显著高于双亲,其中净光合速率、水分利用率分别比母本SC5高39.48%、5.74%,比父本SC10高63.72%、20.11%;叶片总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b含量也均显著高于两亲本,与光合特性参数相吻合。采用高效液相法对木薯有性四倍体及其双亲不同发育时期功能叶、茎秆韧皮部汁液、块根可溶性糖测定比较,分析发现ST在生长发育的不同时期其叶片中的蔗糖、葡萄糖、果糖的含量变化趋势与两亲本相似,其中蔗糖含量在植后130 d后均显著高于双亲;ST在生长发育的前期其茎秆中的蔗糖运输较3、多,含量显著高于两亲本,而发育后期块根对蔗糖利用能力降低抑制了蔗糖的运输,茎秆中蔗糖含量减少;ST在生长发育的不同时期其块根中蔗糖、葡萄糖、果糖的含量变化趋势与两亲本不一致,表现为发育前期蔗糖含量利用率快,块根中蔗糖含量显著低于双亲;发育后期蔗糖利用能力降低,块根中蔗糖逐渐积累,并高于双亲。表明木薯有性四倍体对蔗糖的分解利用模式发生了改变,利用蔗糖进行淀粉积累的时期主要为块根膨大前期。4、分别对木薯有性四倍体及其二倍体亲本进行耐旱、耐阴、耐盐和块根抗采后生理衰变等抗逆性指标评价。结果表明:在干旱胁迫下ST的生长发育较二倍体亲本被抑制程度较低,并可响应落叶机制来减少水分的利用与蒸发;避光胁迫下ST相对于二倍体亲本对避光的耐受力具有明显的优势,其在遮光胁迫下可继续生长发育较长时间,叶片变形但可保持生命力,而二倍体亲本则植株叶片黄化临近死亡;盐胁迫下,ST组织培养幼苗叶片生长发育比二倍体亲本缓慢,但根系更为粗壮,ST由于苗茎更粗壮,相对于二倍体具有一定的耐盐抗逆性,但其本身耐盐性也较低;ST块根相对于双亲具有很强的耐采后生理腐烂能力(PPD),其薯块可在室温下储藏5 w以上保持薯肉新鲜,双亲则在2 w内完全腐烂变质。5、采用透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察木薯有性四倍体及其双亲块根淀粉粒的内部结构及表面大小形态。观察发现ST淀粉粒中“斑马条纹”的密度与双亲不同,即ST淀粉粒的内部结构发生了变化,ST淀粉粒大小介于两亲本之间,淀粉粒外部形态与双亲无明显差异。另外ST膨大期块根淀粉粒填充程度显著高于双亲而成熟期淀粉填充程度与双亲无显著差异,且与膨大后期基本一致,表明ST淀粉颗粒填充时期提前,与淀粉含量积累趋势一致。6、采用气相色谱法分别测定木薯有性四倍体及其双亲块根发酵全过程的酒精含量。结果显示ST块根的酒精转化率趋势与双亲基本一致,在发酵开始的前32 h,酒精含量增加较快,之后增长变缓,36 h后酒精不再增加。发酵停止后,其酒精含量略高于双亲,但差异不显著。此外,发酵8-12h时期内ST的酒精转化速率具有明显的加速阶段。7、对木薯有性多倍体及其双亲膨大期块根进行转录组学比较分析,结果发现ST有性多倍体化后基因表达发生了变化。与母本SC5相比,有2934个差异表达基因,其中1385个基因上调,1549个基因下调;与父本SC10相比,有3171个差异表达基因,其中1592个基因上调,1579个基因下调。这些差异表达基因主要涉及参与生物调节,代谢过程,定位,应激反应和发育过程等。Pathway富集分析显示,ST与双亲相比在“类黄酮生物合成物”和“糖酵解/糖异生”代谢途径显著富集。“类黄酮生物合成物”代谢途径可能与ST抗逆性增强和块根表皮颜色变化相关,“糖酵解/糖异生”代谢途径可能与ST块根淀粉积累和干物率发生变化有关,需要进一步研究验证。7、结合转录组学手段对ST块根早熟杂种优势机理进行研究,结果表明ST与父母本相比,差异表达基因主要集中在块根中蔗糖的分解利用阶段,包括4个基因显著上调表达,分别为转化酶基因:MeNINV8/MeVINV3、蔗糖合成酶基因:MeSuSy2、已糖激酶:MeHXK 2,其中已糖激酶基因MeHXK2差异表达达到极显著水平;1个基因下调表达(转化酶基因:MeVINV2)。而块根中淀粉的合成阶段关键酶基因表达无显著差异。表明ST膨大期块根淀粉含量高于亲本主要是通过对蔗糖的代谢阶段进行调控。进一步对ST及其亲本生长发育不同时期淀粉积累关键酶活性进行测定,证明了 ST块根淀粉提早填充和块根提前膨大成熟主要由块根中转化酶和己糖激酶进行调控。8、分别从生理生化、细胞、分子基因水平上研究了 ST块根抗采后生理衰变(PPD)杂种优势机理。结果显示:ST块根在储存过程中其品质指标干物率、β-胡萝卜素和淀粉含量都比双亲更稳定。在采后生理衰变胁迫下,ST及其双亲都会通过调节与抗逆性相关的代谢酶活系统来清除活性氧,延迟腐烂变质,但ST相对于双亲的酶活系统响应更为活跃,且储藏60 h和2w是ST清除活性氧的酶活调控代谢的关键时期。此外,ST块根抗PPD的最主要响应机制为在染色体加倍基因重组后其块根恢复了类似于其他薯类伤修复的功能,来响应抗采后生理衰变,通过相关酶代谢调控合成木质素来加固细胞壁的结构以此抵御微生物的侵染,从而达到耐储藏,Wiesner染色实验也验证了伤修复产物木质素的存在。进一步对与木质素合成相关的关键酶基因家族的表达进行统计研究,共获得木薯木质素合成途径关键酶10个基因家族(PAL1-6,C4H,4CL,C3H,CCoACMT 1-11,CCR 1-2,F5H 1-2,COMT1-4,CAD1-3,POD1-7),ST 块根储藏过程中 PAL2/5/6、4CL、C3H、CCoAOMT 1/6、CCR 2、CAD 2、POD3基因与双亲相比显著上调,表明这些基因是响应木质素合成的关键基因,而COMT和F5H基因家族主要呈现下调趋势,表明ST倾向于合成G型木质素单体形成结构较紧密的木质素类型,来抵御细胞壁受微生物的侵染。