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背景和目的:肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病的最终共同途径。近来发现,肾小管上皮细胞间质转分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是肾间质纤维化发生发展的重要机制。肾小管上皮细胞转分化是一个有序的发生过程,E-cadherin介导的细胞-细胞的粘附功能丧失被认为是EMT的关键步骤。EMT最早期改变就是E-cadherin的表达抑制,随着E-cadherin的丢失,细胞间的紧密连接遭到破坏,使上皮细胞失去粘附特性。Snail、Slug基因属于锌指转录因子超家族成员,可以通过与靶基因的E-box结构域结合从而抑制其转录。在多个细胞系统研究中发现,Snail通过与E-cadherin启动元件E-box结合,对E-cadherin的转录进行直接抑制,下调其表达,从而使上皮细胞间失去粘附,促进EMT的发生,参与胚胎发育、肿瘤转移及组织纤维化过程。EMT信号系统中多个重要信号途径如转化生长因子-β1-Smad、Wnt/β-catenin/淋巴增强因子、Ras/MAPK/细胞外调节蛋白激酶通路等均可调节调节Snail与Slug基因在细胞内的表达表达。但Snail及Slug在人肾小管EMT过程中作用机制的研究尚未见报道。本研究拟采用siRNA技术,探讨slug与snail基因在EMT中的作用机制,为防治肾纤维化提供新的思路。方法:1.针对Snail、Slug基因mRNA的RNA干扰质粒的构建根据人Snail、Slug基因的mRNA,采用RNAi设计软件,进行全基因组扫描和序列同源性分析,设计针对Genbank中Snail、Slug基因的特异siRNA,同时设计序列相同的阴性对照组。采用siRNA表达载体的方法体外制备人类Snail基因与Slug基因的siRNA真核表达载体。用阳性脂质体LipofectamineTM2000进行HKCs的siRNA转染,倒置显微镜下观察细胞形态。2.实验分组:将HKCs分组如下:①对照组(C组):用无血清培养基(free serum medium,FSM)培养48h;②TGF-β1培养处理HKCs组(T组):用含TGF-β1(20ng/ml)的FSM培养HKCs 48h;③TGF-β1培养处理HKCs-siRNA组(T+siR组):用含TGF-β1(20ng/ml)的FSM培养HKCs-snail-siRNA 48h为T+siRa亚组,用含TGF-β1(20ng/ml)的FSM培养HKCs-slug-siRNA 48h为T+siRb亚组;④TGF-β1培养处理HKCs-siC组(T+siC组):用含TGF-β1(20ng/ml)的FSM培养HKCs-snail-siC 48h为T+siCa亚组,用含TGF-β1(20ng/ml)的FSM培养HKCs-slug-siC 48h为T+siCb亚组。3.RT-PCR方法各组细胞α-SMA、E-cadherin、Snail及Slug基因表达水平。4.Western blot方法检测各组细胞α-SMA、E-cadherin、Snail及Slug在蛋白水平的表达。5.免疫荧光检测各组HKCs的E-cadherin及α-SMA表达。结果:1.分别成功构建Snail、Slug基因的siRNA重组质粒,用阳性脂质体Lipofect amineTM2000转染细胞,转染效率达60%。2.构建TGF-β1诱导的EMT体外细胞培养模型,倒置显微镜下观察细胞形态:C组呈铺路石样紧密排列生长;T组与siC组细胞均出现显著形态改变,类似于成纤维细胞呈长梭形,细胞间间距增大,多数细胞呈离散型生长;T+siRa组及T+siRb组细胞形态改变不明显,仅有少量细胞呈现长梭形;提示沉默Snail及Slug基因可抑制EMT的发生。3.RT-PCR、Western blot方法检测各组细胞α-SMA、E-cadherin、Snail及Slug的表达:C组E-cadherin在基因和蛋白水平均有较强表达,α-SMA无表达,Snail与Slug表达均较弱;T组与siC组E-cadherin表达减弱,Snail、Slug表达明显增强,α-SMA表达明显增强;T+siRa组及T+siRb组E-cadherin表达增强,α-SMA表达较弱;提示抑制Snail及Slug基因可重建E-cadherin表达。4.免疫荧光观察细胞E-cadherin、α-SMA的表达:C组HKCs细胞膜和胞浆E-cadherin表达均为阳性,而α-SMA表达为阴性;T组与siC组均可见E-cadherin表达显著下降,而α-SMA表达为明显增加;T+siRa组与T+siRb组E-cadherin表达增强,α-SMA表达较弱。结论:1.RNA干扰技术可沉默Snail、Slug基因的表达,从而阻断其生物学作用;2.Snail、Slug基因与EMT密切相关,抑制Snail、Slug基因的表达可显著上调E-cadherin的表达,从而抑制EMT发生;3.Snail、Slug基因可作为新靶点,在EMT防治中起重要作用。