胰腺癌是所有实体肿瘤中恶性程度最高的恶性肿瘤之一,发病率接近死亡率,且发病率逐年升高,严重影响了人类的生命健康。目前手术仍然是唯一可能根治胰腺癌的手段,然而即使是行根治性手术,胰腺癌患者的5年生存率仍低于20%。研究显示,对于获得根治性手术的患者,淋巴转移是重要的独立预后因素。胰腺癌患者术后病理证实淋巴转移率高达60%。目前有关胰腺癌淋巴结转移特性研究及其治疗已成为业界的研究热点。目前国内外尚缺乏理想的胰腺癌淋巴道转移模型。因此,建立一稳定胰腺癌高淋巴转移动物模型意义深远,该模型将为我们后期对胰腺癌淋巴转移机制的研究、抗肿瘤药物的筛选建立实验平台。第一部分：建立人胰腺癌高淋巴转移细胞系BxPC-3LN目的：本课题希望通过将人胰腺癌细胞株BxPC-3裸鼠爪垫皮下连续接种法建立淋巴道转移模型,筛选、建立高淋巴转移胰腺癌细胞系BxPC-3LN。方法：通过将人胰腺癌细胞株BxPC-3裸鼠爪垫皮下连续接种法建立淋巴道转移模型,筛选、建立高淋巴转移胰腺癌细胞系,并通过光学显微镜、电子显微镜、流式细胞仪周期测定、细胞增殖实验、细胞粘附迁移侵袭、基因芯片等实验方法进行两株细胞系问的差异研究。结果：成功构建了裸鼠人胰腺癌细胞株BxPC-3淋巴道转移模型,获得了具有高侵袭性、高淋巴转移能力的胰腺癌BxPC-3-LN细胞系。该亚系接种到裸鼠爪垫后8周,100%发生明显的淋巴结转移。该细胞系具有侵袭力强、转移效率高、高淋巴结转移以及化疗抵抗等特点,在胰腺原位和爪垫的成瘤能力明显强于母系BxPC-3细胞,其淋巴结转移的发生率明显高于母代细胞。通过cDNA芯片分析,促转移相关基因MMP14.MMP24、MIF和ADRM1表达上调,而转移抑制相关基因TGFB2和ROBO1表达下调。第二部分：高淋巴道转移细胞系BxPC-3-LN的干性特征初步研究目的：进一步探讨BxPC-3-LN细胞系的肿瘤干细胞成分及相关调控机制。方法：通过裸鼠爪垫皮下接种成瘤实验观察肿瘤的形成及淋巴结转移情况；通过体外细胞悬浮成球及克隆形成实验检测两细胞系的自我更新能力；并进一步通过细胞免疫荧光及RT-PCR技术分析两细胞系SHH基因表达情况。此外,通过miRNAPCR芯片技术分析两细胞系miRNAs的差异性表达。结果：与母系BxPC-3相比,BxPC-3-LN细胞系具有较明显肿瘤干细胞特性,包括体内淋巴转移潜能、成瘤能力、自我更新能力、化疗耐药等。此外,BxPC-3-LN细胞系高表达sonic hedgehog蛋白及转移起始干细胞表面标志物CD133和CXCR4。吉西他滨联合SHH信号通路阻滞剂环杷明可以明显抑制BxPC-3-LN细胞生长。BxPC-3-LN细胞系较母系BxPC-3低表达let-7、miR-34、miR-107、 miR-125、miR-128、miR-130、miR-132、miR-141的表达,这些miRNAs与肿瘤干细胞相关因子的表达调控密切相关。结论：1、该细胞系为胰腺癌转移机理的研究和抗肿瘤药物的筛选提供了合适的实验平台,同时具有重要的科学意义和应用前景。2、肿瘤干细胞参与了胰腺癌淋巴转移的过程,某些miRNAs可能通过肿瘤干细胞的形成与维持参与了胰腺癌的侵袭转移过程的调控。