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背景：目前,恶性肿瘤是威胁人类生命、健康最严重的疾病之一,对肿瘤的治疗是医学界的重点和难点。现阶段,化疗仍是治疗恶性肿瘤的主要手段之一。但由于临床工作中化疗药物的广泛使用,多药耐药的情况频繁发生增加了治疗的难度,使化疗的总体成功率不高,成为治疗肿瘤的最大障碍。如何提高化疗药物治疗的敏感性的同时降低药物量,减少其毒副作用是使用化疗药物急需解决的关键问题之一。近年来,超声靶向破坏微泡(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技术发展迅速,该技术可促进肿瘤对化疗药物的吸收,在肿瘤治疗领域展现出良好的应用前景。多数研究采用治疗超声仪,但不能准确定位深部肿瘤且由于其强度较高存在潜在的安全隐患。因此,有学者尝试采用二维诊断超声应用于治疗领域,结果证实诊断超声联合微泡可以增加鼠正常肝脏血管通透性及皮下移植肝癌血管通透性。但二维诊断超声声束仅在一个较小的立体角内传播,存在辐照范围小及辐照不均匀的不足。实时三维超声是一种立体超声扫查技术,可以进行空间上的“金字塔形”扫查,可以完全覆盖肿瘤。瘤内注射微泡,使微泡绕过了微血管屏障,可直接与瘤细胞接触,不需要通过肺循环,避免了微泡经肺循环造成的微泡损失,延长了微泡瘤内存留时间。还可保证瘤内有较高微泡浓度的同时最大限度减少药物浓度,减少药物的副作用。但实时三维超声激励微泡对肿瘤化疗效果影响的实验研究鲜有报道。因此,本实验采用实时三维诊断超声联合瘤内注射微泡的方式作用于瘤体,探讨实时三维诊断超声联合瘤内注射微泡增敏肿瘤化疗的可行性。目的：1.探讨实时三维诊断超声联合瘤内注射微泡增加在体肿瘤细胞膜通透性的可行性,利用硝酸镧示踪法观察机械指数(Medical index,MI)、辐照时间对肿瘤细胞膜通透性的影响,寻找到最佳治疗声学参数。2.探讨实时三维诊断超声联合瘤内注射微泡增强兔VX2移植瘤化疗效果。材料和方法：1.主要实验材料实验仪器：超声辐照仪采用ViVi E9(GE公司制造),3V-D探头,频率1.5-4.0 MHz,MI可调。超声诊断仪采用Philips iU22彩色多普勒超声仪,L12-5高频线阵探头,配有超声造影模式。Hitachi H-7650透射电子显微镜。OLYMPUSBX51荧光正置显微镜。石蜡包埋机(德国Leica EG1160)。石蜡切片机(德国Leica RM2235)。超声微泡：采用我院自制“全氟显”,其成膜材料为人血白蛋白,核心气体为全氟丙烷。实验时以3ml生理盐水溶解并缓慢振荡、摇匀,所产生的微泡粒径范围2.5-4.0μm,浓度0.8-2.2×109个/ml。用于超声造影检查和瘤内注射。其他试剂：多柔比星,速眠新,阿托品,戊巴比妥钠,TUNEL法原位细胞凋亡试剂盒,硝酸镧。2.动物模型制备：90只健康新西兰大白兔用作模型兔,雌雄不限,体质量2.5-3.0kg。另取4只健康新西兰大白兔作为传代兔(所有实验动物由南方医科大学南方医院实验动物中心提供)。将冻存的VX2廇株(由广州中山大学实验动物中心提供)常规复苏,分别制成2 ml组织悬液,接种至传代兔右后肢外侧肌层内。待肿瘤长至约2 cm,将荷瘤兔右后腿用0.35 ml/kg速眠新Ⅱ注射液和0.25 ml/kg阿托品注射液肌肉注麻醉,建立耳缘静脉通路以注射适量3%戊巴比妥钠,侧卧位保定于实验台,荷瘤部位及其周围1.5 cm处脱毛,常规消毒,无菌条件下取出瘤体,剔除周边筋膜、结缔组织及中央坏死部分,将剩余的新鲜鱼肉样肿瘤组织置于无菌生理盐水中,眼科剪将其剪成1 mm3的瘤粒备用。90只实验兔按上述方法麻醉、消毒,将备好的瘤粒分别接种至90只模型兔右侧后肢外侧肌层内。3.实验流程：(1)三维超声联合瘤内注射微泡对兔VX2肿瘤细胞膜通透性影响因素的研究：①分组：以机械指数(MI)和辐照时间为处理因素将45只成功建立VX2移植瘤模型的的新西兰白兔随机分成2组,各处理因素又各分为5个水平,分别为MI为0、0.1、0.5、1.0、1.3,辐照时间为0、5min、10min、15min、20 min。考察某一因素各水平间差异时另一因素水平固定不变,每一水平重复5次。以肿瘤细胞内硝酸镧颗粒数目作为判断细胞膜通透性改变的指标,通过定量的方法观察不同机械指数、辐照时间对肿瘤细胞膜通透性的影响,并得到最佳参数。②操作流程：辐照前,瘤内注射微泡,剂量依肿瘤体积而定,约1 ml×肿瘤体积(cm3),随后采用ViVi E9超声仪3V-D探头按各处理因素辐照瘤体,辐照结束后,取肿瘤组织,行硝酸镧染色,透射电镜观察肿瘤细胞超微结构改变及细胞内镧颗粒数量。③镧颗粒评分标准：随机选取同一切片的10个肿瘤细胞。0分：肿瘤细胞内未见镧颗粒；1分：肿瘤细胞内见1-3个镧颗粒；2分：肿瘤细胞内见4-9个镧颗粒；3分：肿瘤细胞内见10-14个镧颗粒；4分：肿瘤细胞内见15-19个镧颗粒;5分：肿瘤细胞内见镧颗粒数目≥20个。(2)三维诊断超声联合瘤内注射微泡增强VX2移植瘤化疗效果的实验研究：①超声辐照程序：将35只成功建立VX2移植瘤模型的的新西兰白兔随机分成7组(每组5只),三维超声+瘤内注射微泡+多柔比星组(3D+MB(瘤内注射)+Dox)：耳缘静脉注射多柔比星后瘤内注射微泡,随即三维超声辐照肿瘤；三维超声+静脉注射微泡+多柔比星组(3D+MB(静脉注射)+Dox)：耳缘静脉注射多柔比星后经静脉注射微泡,随即三维超声辐照肿瘤；二维超声+瘤内注射微泡+多柔比星组(2D+MB(瘤内注射)+Dox)：耳缘静脉注射多柔比星后瘤内注射微泡,随即二维超声辐照肿瘤；多柔比星组(Dox)：耳缘静脉注射多柔比星后瘤内注射生理盐水代替微泡,超声假照肿瘤；三维超声+多柔比星组(3D+Dox):耳缘静脉注射多柔比星后瘤内注射生理盐水代替微泡,随即三维超声辐照肿瘤;三维超声+瘤内注射微泡组(3D+MB(瘤内注射))：耳缘静脉注射生理盐水代替多柔比星后瘤内注射微泡,随即三维超声辐照肿瘤；对照组(Control):耳缘静脉注射生理盐水代替多柔比星后瘤内注射生理盐水代替微泡,超声假照肿瘤。辐照时间10 min,机械指数1.3,瘤内注射微泡量依肿瘤体积而定,约1 ml×肿瘤体积(cm3),静脉注射微泡量1 ml,静脉注射多柔比星剂量1.25 ml/kg,生理盐水与相应替代试剂量相同。每组于第1、3、5、8天对肿瘤进行治疗,共治疗4次。治疗后第10天剥离肿瘤,计算各组肿瘤体积生长率。取肿瘤组织,行凋亡检测及HE染色。②分析方法：采用TUNEL法检测细胞凋亡。凋亡细胞判定标准：呈明显褐色的细胞为阳性凋亡细胞。在光学显微镜下随机挑选5个视野(10×40倍镜下)进行细胞计数(细胞总数每组不少于500个),累计计算5个视野的凋亡细胞数及细胞总数。按公式：细胞凋亡指数(AI)(%)=凋亡细胞数/细胞总数x100%计算凋亡指数。4.数据分析：采用SPSS13.0统计分析软件包对数据进行处理,肿瘤体积、镧颗粒评分均用x±s表示。不同处理因素的各水平肿瘤体积比较采用单方向方差分析(One-Way ANOVA);同一处理因素多水平间镧颗粒数目评分比较采用多个独立样本非参数检验(K Independent Samples Tests),若同一处理因素总体差异有统计学意义,则采用两独立样本非参数检验(2 Independent Samples Tests)对任意两水平间进行比较。单因素方差分析比较同一时间组间肿瘤体积大小及生长率。各组间凋亡指数比较采用单因素方差分析,两两比较采用Tukey检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果：1.三维超声联合瘤内注射微泡对兔VX2肿瘤细胞膜通透性影响因素的研究：MI为0时,细胞内未见镧颗粒,细胞连接处可见镧颗粒呈线状分布,随着MI增大,细胞内镧颗粒数量增多,MI为1.3时,细胞内镧颗粒数量最多,评分最高与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.01)；随着辐照时间增加,细胞内镧颗粒数量增多,镧颗粒评分增高,与MI为0时比较差异有统计学意义(P<0.01),但当辐照时间超过10 mmin时,细胞内镧颗粒数目、评分没有明显变化(P>0.05)；各组细胞核内均未见明显镧颗粒存在,但部分组肿瘤细胞线粒体、内质网空化明显,内见镧颗粒。2.三维诊断超声联合瘤内注射微泡增强兔VX2移植瘤化疗效果的实验研究：肿瘤体积：治疗前,各组肿瘤体积(0.25-0.37 cm3)无统计学差异(P>0.05);治疗结束后,3D+MB(瘤内注射)+Dox组、3D+MB(静脉注射)+Dox组、2D+MB(瘤内注射)+Dox组、Dox组、3D+Dox组、3D+MB(瘤内注射)组、Control组肿瘤体积分别为0.80±0.05cm3、1.60±0.24 cm3,1.83±0.32 cm3,2.30±0.20 cm3、 2.46±0.10 cm3,2.46±0.19 cm3,3.57±0.37 cm3,3D+MB(瘤内注射)+Dox组体积显著小于其余各组,差异有统计学意义(P<0.05)；3D+MB(瘤内注射)+Dox组、3D+MB(静脉注射)+Dox组、2D+MB(瘤内注射)+Dox组、Dox组、3D+Dox组、3D+MB(瘤内注射)组、Control组肿瘤体积生长率分别为3.19、6.19、8.30、9.62、7.40、8.43、12.16。3D+MB(瘤内注射)+Dox组肿瘤生长率较低,与其余各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡指数：治疗结束后,3D+MB(瘤内注射)+Dox组、3D+MB(静脉注射)+Dox组、2D+MB(瘤内注射)+Dox组、Dox组、3D+Dox组、3D+MB(瘤内注射)组、Control组细胞凋亡指数(%)分别为45.99±5.64、27.65±2.74、25.68±2.64、13.78±1.81、16.87±3.09、15.17±2.76、9.44±1.93,3D+MB(瘤内注射)+Dox组凋亡指数较高,与其余各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1.实时三维超声联合瘤内注射微泡可以增加兔VX2肿瘤细胞膜通透性,且实时三维超声联合瘤内注射微泡产生的空化效应可能改变肿瘤细胞线粒体膜通透性。2.机械指数、辐照时间可影响肿瘤细胞膜通透性,在一定范围内,提高机械指数和辐照时间可以增加肿瘤细胞膜通透性。3.实时三维诊断超声联合瘤内注射微泡产生“空化效应”可以增敏多柔比星的化疗效果,该方法治疗操作损伤小、方法简便、可重复使用、易于推广。