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反10,顺12-共轭亚油酸(t10,c12-CLA)具有减少脂质积累、抗肿瘤、增强机体免疫力等诸多生理功能,可用于减肥和医药产品的开发,在食品、保健品和药品行业具有巨大的应用价值。生物合成法能合成结构单一、安全性高的t10,c12-CLA,但是目前的产量无法满足工业生产需要。亚油酸异构酶(PAI)来源于痤疮丙酸杆菌(Propionibactereium acnes),能够催化亚油酸(c9,c12-LA)转化为t10,c12-CLA,本实验室成功构建的一株重组解脂耶氏酵母能够在细胞内异源表达PAI,为生物催化合成t10,c12-CLA提供了基础。本文主要研究了重组解脂耶氏酵母细胞内PAI的分离纯化、PAI的酶学性质及催化反应动力学、全细胞催化合成t10,c12-CLA条件和体系的优化。首先,亚油酸异构酶(PAI)的分离纯化,通过Hitrap DEAE FF阴离子交换层析柱、Hitrap Butyl HP疏水层析柱、Superdux 200 10/300GL凝胶过滤层析,成功从重组解脂耶氏酵母细胞内分离得到电泳纯的PAI酶蛋白,PAI分子量约48 kDa,收率约为28%,与PAI粗酶液相比,纯化约9.8倍。其次,PAI酶学性质及催化反应动力学研究,最适反应温度为37℃,最适pH为7.5,酶在不同温度条件下保存,稳定性差异较大;金属离子Al3+能够提高8%的酶活,Mg2+对PAI的酶活基本无影响,其余金属离子对酶活都存在抑制作用;低浓度的0.1 M吐温80和CTAB能够提高PAI酶活性,高浓度表面活性剂使酶活性降低;其它类脂肪酸都会抑制PAI的活力。研究了底物对酶催化反应的影响,以c9,c12-LA为底物时,PAI不存在底物抑制作用,米氏常数Km为84.68μmol/L,Vmax为2098.79 nmol/min/mg。同时,PAI存在产物抑制作用,进一步研究表明为可逆的竞争性抑制。然后,全细胞催化剂制备,含5 g/L的油酸培养基培养重组解脂耶氏酵母,透射电子显微镜观察到细胞壁和细胞膜的间隙(周质空间)扩大,提高了底物和产物进出菌体的效率,c9,c12-LA合成时间缩短20小时,提高t10,c12-CLA产物产量。同时,采用液氮反复冻融的透性化处理方式,使得t10,c12-CLA产量提高了13.81%,菌体活力维持在97.77%。最后,重组解脂耶氏酵母全细胞催化合成t10,c12-CLA的条件和体系的优化,合适的催化条件为:28℃、pH 7、200 rpm、无需限制氧气;0.1 M磷酸盐缓冲液、底物浓度25 g/L、添加乙酸钠至1.5 g/L,反应时间40 h;最终实现3次多批次高效催化,细胞外t10,c12-CLA产量高于10 g/L,共加入c9,c12-LA底物75 g/L,催化反应120 h,胞外t10,c12-CLA总产量达到31.11 g/L,转化率为41.48%,是目前已报道的单体t10,c12-CLA生物合成最高产量。本论文从酶和细胞两方面开展研究,为工业化生物合成t10,c12-CLA打下了坚实的理论和应用基础。