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目的1.克隆土拨鼠和旱獭CD4分子。制备多克隆,单克隆抗体,并对其特性进行初步鉴定。2.建立小鼠和旱獭的淋巴细胞增殖试验检测方法,为wCD4抗体的动物实验做准备。方法1.从土拨鼠PBMC中克隆CD4的cDNA序列,测序并比对分析wCD4和其它哺乳动物CD4的核苷酸、氨基酸同源性。2.从中国旱獭PBMC中克隆CD4的cDNA序列,测序并比对分析wCD4和cwCD4序列同源性。3.从旱獭肝组织或新鲜分离的PBMC中,用蛋白酶K消化和酚／氯仿抽提的方法获得DNA。PCR扩增旱獭细胞色素b基因进行种系发生分析。4.实时荧光定量PCR检测感染WHV的旱獭肝内CD4的表达水平的变化。为以后的CD4抗体体内试验提供理论依据。5.原核诱导表达纯化wCD4蛋白,免疫兔子制备wCD4的多克隆抗体,鉴定抗体的效价和特异性。6.原核表达纯化的wCD4蛋白以Al(OH)3佐剂化,常规免疫Balb/c小鼠。通过细胞融合技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2／0和免疫后的小鼠脾细胞融合,用免疫原蛋白包被板子经ELISA方法进行初筛。经真核表达质粒CD4转染BHK细胞后做免疫荧光复筛。得到的阳性克隆,通过三次有限稀释法,筛选出稳定分泌anti-wCD4的杂交瘤细胞。收集杂交瘤细胞的培养上清液,采用ELISA方法测定单克隆抗体Ig亚类。用杂交瘤细胞制备小鼠腹水。测定腹水和培养上清液中的抗体效价。将小鼠腹水经辛酸-硫酸铵纯化。7.采用ELISA, Western blot, IF对wCD4单克隆抗体进行特异性的鉴定。8.用wCD4采用Western blot, IF, IHC的方法检测旱獭PBMC和肝内CD4+T淋巴细胞。9.采用MTT法和CFSE法检测小鼠脾细胞和旱獭PBMC细胞的增结果1.获得土拨鼠CD4分子全长序列共1359bp,核苷酸序列与人、猩猩、兔、猫、猪、狗、小鼠、大鼠、鸭、鸡的同源性分别为76.00%、75.33%、73.13%、72.39%、71.29%、71.15%、69.09%、69.31%、53.89%、52.79%。2.获得旱獭CD4胞外段序列,和土拨鼠CD4分子比对,核苷酸同源性99.6%。3.通过种系发生分析,发现旱獭和土拨鼠高度同源。4. RT-PCR法检测旱獭WHV感染后,肝内CD4 mRNA在感染后第二周有表达高峰。提示WHV感染后,CD4在早期就开始活化。为以后的动物实验提供了CD4阻断的时间点。5.成功构建土拨鼠CD4的原核表达载体,转化BL21表达菌,经过大量诱导表达纯化获得目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得高效价的特异性多克隆抗体,通过酶联免疫吸附实验(ELISA), Western blot,免疫荧光检测,抗体的灵敏度和特异性均较高.为以后的单克隆抗体制备提供了筛选依据。6.获得四株可稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞,命名为G1；G2；C9；C10。所分泌单克隆抗体均属IgG1亚类。经持续6个月培养,低血清适应以及反复冻存与复苏后,仍能保持其稳定的细胞增殖和抗体分泌能力。细胞培养上清中抗体效价为103-104,腹水中抗体效价为107-108。7.采用Western blot, IF的方法,该四株单克隆抗体均能识别真核表达质粒PcDNA3.1-wCD4转染BHK后表达的wCD4分子。因为该四株抗体都可以用于WBIF的检测,所以推断该四株抗体识别的应为CD4分子天然构象中的线性表位。8.采用IF, IHC的方法,该四株抗体均能识别旱獭PBMC中的CD4+T细胞。9.采用IHC的方法,发现旱獭WHV感染后,第五周肝内CD4+T细胞细胞浸润明显增加。10.成功建立小鼠和旱獭流式检测细胞增值试验的方法。为以后的动物实验奠定了基础。结论1.成功克隆出土拨鼠CD4全长和旱獭CD4部分序列,经过比对发现他们的同源性99.6%。旱獭种系发生分析结果显示中国旱獭和土拨鼠高度同源。为进一步在土拨鼠、旱獭动物模型中研究WHV和免疫系统之间的关系奠定了基础。2.成功制备了特异性的高效价抗woodchuck CD4多克隆抗体。该多克隆抗体可以检测到真核表达质粒PcDNA3.1-wCD4转染BHK后细胞表面表达的wCD4.为下一步的单抗筛选奠定基础。3.成功制备了四株能分泌抗土拨鼠CD4的单克隆抗体的杂交瘤细胞。该四株单抗均能识别转染表达的土拨鼠CD4分子。该四株单抗均能识别旱獭PBMC的CD4+T细胞。4.通过实时定量PCR的方法和wCD4单抗免疫组化的方法均检测到旱獭感染早期,CD4+T细胞在肝内开始活化增殖。为以后的CD4体内阻断试验提供依据。