【摘 要】
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目的:建立2b蛋白稳定表达的细胞株。 方法:提取PRRSVCC-1株的总RNA，登陆Genebank，根据其公布的PRRSVCC-1株的碱基序列，应用Primer5与Oligo6软件设计一对2b基因的特异性引物。
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目的:建立2b蛋白稳定表达的细胞株。 方法:提取PRRSVCC-1株的总RNA，登陆Genebank，根据其公布的PRRSVCC-1株的碱基序列，应用Primer5与Oligo6软件设计一对2b基因的特异性引物。摸索PCR扩增条件扩增成功后，凝胶电泳并回收目的片段。将该片段与pMD18-T克隆载体相连。转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞。筛选转化成功的阳性克隆菌。提取质粒，并进行PCR和单双酶切鉴定。鉴定成功后送至测序。构建2b蛋白基因的原核表达载体和真核表达载体:酶切构建成功的pMD18-T-2b重组质粒，构建pET-30a-2b和pEGFP-N1-2b重组质粒并将其转至大肠杆菌BL21感受态细胞中。筛选成功的pET-30a-2b/BL21阳性菌株在IPTG终浓度为1mM，28℃条件下进行诱导表达，通过蛋白电泳SDS-PAGE鉴定正确后，运用Ni2+亲和层析法在自然条件下纯化重组蛋白，免疫家兔，制备多克隆抗体，进行Western-Blot鉴定。pEGFP-N1-2b/BL21阳性菌株鉴定完成后，大量提取质粒，通过脂质体介导的转染方法，将重组质粒转染Marc-145细胞，在荧光倒置显微镜下观察。转染后进行细胞株筛选，进行目的基因转录、Western-Blot。 结果: 1、成功克隆了PRRSV2b蛋白目的基因。该片段碱基序列为222bp，编码73个氨基酸。 2、成功构建了pET-30a-b/BL21原核表达载体，蛋白电泳SDS-PAGE鉴定所表达的蛋白大小为17KD，成功制备多克隆抗体。Western-Blot鉴定大小与预期一致。 3、成功构建了pEGFP-N1-2b/BL21真核表达载体，建立稳定表达的Marc-145-2b细胞株 结论:建立稳定表达的Marc-145-2b细胞株，为研究2b蛋白如何与宿主细胞结合形成通道，PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定基础。
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