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特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis ,IPF)是一种原因不明、以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病。主要临床表现是逐渐加重的呼吸困难,伴有刺激性干咳,病情一般持续进展,最终因呼吸衰竭而病死,其发病率和死亡率很高,预后极差。IPF的发病机制尚未明了,然而目前肺纤维化治疗尚无特效药物,IPF已成为临床治疗的难点。研究肺纤维化发病机理和寻找行之有效的治疗药物是目前医学界迫切需要解决的课题。中医经典名方当归补血汤由当归、黄芪组成,两者均有抗肺纤维化作用。前期研究表明,对于博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型,当归补血总苷能明显减轻肺泡炎症和纤维化程度。本课题拟观察肺纤维化形成过程中胶原基质重塑在IPF发病机制中的动态变化,探索IPF防治新的作用靶点。同时在整体水平上研究当归补血总苷对IPF胶原基质重塑的调控作用从而探讨其对IPF的防治作用及机制,研究当归补血总苷对实验性肺纤维化形成过程中TGF-β1等细胞因子的影响,以及对MMPs和TIMPs局部表达失衡的调节作用,和其对TGF-β1/Smads信号转导通路的影响,为中医药益气活血协同抗肺纤维化提供现代科学依据。目的制备当归补血总苷并建立其质量控制标准,优选当归补血汤中有效部位的提取工艺,建立当归补血总苷HPLC指纹图谱,并以此考察当归补血总苷的质量。观察当归补血总苷对实验性肺纤维化大鼠肺系数及肺组织病理形态的影响以及血清中HA,LN,PCⅢ、CⅣ,TGF-β1,COLⅠ和IL-13水平的变化;探讨肺纤维化大鼠肺组织中MMP-1、MMP-9与TIMP-1 mRNA的改变,并观察当归补血总苷对肺纤维化大鼠肺组织、MMP-1、MMP-9与TIMP-1表达的影响;探讨PF模型中体内成纤维细胞表型转分化和TGF-β1-Smad3途径在肺纤维化发生发展中的作用,阐明当归补血总苷对肺成纤维细胞表型转分化及TGF-β/Smads信号转导通路的影响及其机制。方法采用薄层色谱法对当归补血总苷中的黄芪甲苷和阿魏酸进行定性鉴别;采用紫外分光光度法测定当归补血总苷的含量;采用HPLC法测定当归补血总苷中的黄芪甲苷、黄芪苷Ⅱ和阿魏酸的含量。设计L9(34)正交试验,采用HPLC法测定黄芪甲苷、阿魏酸的含量作为质控指标,考察乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取时间(C)和提取次数(D)4个因素对当归补血总苷提取的影响,优化提取工艺。采用HPLC-DAD,Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),乙腈―水二元梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,(λ=203 nm),柱温为30℃,建立了当归补血总苷的HPLC指纹图谱。180只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、强的松组和当归补血总苷大、中、小剂量组,每组30只。除正常对照组外,其他五组均采用经气管滴注博莱霉素A5建立大鼠肺纤维化模型,造模后第二日起当归补血总苷大、中、小剂量组每天用当归补血总苷(剂量64、32、16 mg·kg-1)灌胃,强的松组用醋酸强的松混悬液(剂量3 mg·kg-1)灌胃,每日一次,每组分别于7、14和28天随机处死10只大鼠采集肺组织,观察各组光镜、电镜(当归补血总苷组中剂量组)下的病理学变化以及比较各组肺系数,以及血清中HA,LN,PCⅢ、CⅣ,TGF-β1,COLⅠ和IL-13水平的变化。RT-PCR法检测当归补血总苷对肺纤维化大鼠肺组织MMP-1、MMP-9与TIMP-1 mRNA表达的影响;Western blotting和RT-PCR法分别检测大鼠正常组、模型组、当归补血总苷组不同组别中a-SMA、TGF-β、COLⅠ、Smad3、P-Smad3等蛋白及mRNA的表达。结果黄芪甲苷在0.85～6.76μg之间呈良好的线性关系(r=0.9992),平均回收率为97.53%,RSD为0.82%。黄芪苷Ⅱ在1.05～8.4μg之间呈良好的线性关系(r=0.9994),平均回收率为94.82%,RSD为2.16%。阿魏酸在0.07～0.53μg之间呈良好的线性关系(r=0.9998),平均回收率为99.74%,RSD为1.62%。最佳提取条件为采用8倍量70%乙醇提取2次,每次2h。建立的当归补血总苷的HPLC指纹图谱确定了12个共有峰,各峰相对保留时间的RSD在0.2~1.0%之间,相对峰面积的RSD在1.6 ~3.2%之间。结果发现,不同批次当归补血总苷质量基本稳定,通过HPLC指纹图谱能够较好地控制其质量。与模型对照组相比,TGDGBX (16-64 mg·kg-1)及强的松组肺系数明显降低(P<0.01),肺组织病理观察显示肺泡炎及肺纤维化程度均明显减轻;TGDGBX (16-64 mg·kg-1)能显著降低BLM诱导的PF大鼠血清中升高的的HA,LN,PCⅢ和CⅣ水平,显著降低PF大鼠血清中IL-13含量,且造模后7、14和28 d三个时间点均有效。TGDGBX (16-64 mg·kg-1)可抑制BLM诱导的肺纤维化大鼠肺组织在肺纤维化不同阶段MMP-1 mRNA、MMP-9 mRNA的表达,提高TIMP-1mRNA的表达,使MMPs/TIMPs表达趋于平衡。进一步研究发现,TGDGBX (16-64 mg·kg-1)可以显著降低PF大鼠血清中升高的TGF-β1和COLⅠ水平。TGDGBX (16-64 mg·kg-1)可明显抑制肺纤维化不同阶段肺组织α-SMA和TGF-β1的表达,抑制肺组织升高的α-SMA、TGF-β1、COLⅠmRNA和蛋白的表达水平;下调肺纤维化不同阶段肺组织升高的Smad 3、P-Smad 3蛋白和Smad3 mRNA水平。结论该提取工艺稳定性和重现性良好,简便,快速,可行;本方法制备的TGDGBX质量可控,检测方法精密度、重现性良好,准确,适用于TGDGBX的质量控制。TGDGBX能减轻肺泡炎性水肿、保持肺泡结构及阻抑纤维化形成,能够明显减少博莱霉素诱导肺纤维化大鼠ECM的生成,提示其对肺纤维化有一定防治作用。TGDGBX抗PF可能与其降低血清中升高的TGF-β1水平、促进COLⅠ胶原降解作用有关。提示TGDGBX可能通过对调节MMP1、MMP9/TIMP1表达实现对ECM重塑的调控;TGDGBX可通过TGF-β1环节下调Smad3和P-Smad 3表达,降低COLⅠ表达,从而减少ECM胶原沉积,发挥抗PF作用。但TGF-β1/Smads的改变与MMPs/TIMPs水平的相关性等尚需进一步研究。