论文部分内容阅读
目的化疗是肿瘤治疗的一个重要手段。但目前绝大多数化疗药物在发挥抑瘤作用的同时会引起机体严重的副作用，因而影响其最终疗效。如何选择合适的化疗药物及给药方式，使其在体内最大程度的发挥药理作用并尽量减少并发症一直是医学研究的重点。近些年发展起来的超声介导的药物靶向运输治疗肿瘤已成为研究的热点问题。本实验通过研制新型多聚体超声微泡作为药物载体，携带抗肾癌药物舒尼替尼形成新型多聚体微泡-药物复合体，评估离体实验中其在超声辐照的作用下对人肾癌GRC-1细胞的增殖抑制及诱导凋亡效应，并初步探索将其应用于在体肾癌靶向治疗的可行性和有效性。方法制备携带有药物舒尼替尼的新型多聚体微泡，将表面活性剂Span60、Tween80以及不同聚合度的PEG溶于PBS中，向溶液内通入SF6气体，应用高强度超声处理得到超声微泡，同时利用跨膜铵梯度法制备得到包含有药物舒尼替尼的脂质体，将超声微泡和载药脂质体直接混合得到新型多聚体微泡-药物复合体。采用库尔特粒度仪检测微泡及脂质体的粒径分布，通过Photoshop软件进行图像分析评估微泡浓度，通过吸光度检测计算脂质体对药物舒尼替尼的包封率。应用荧光胆固醇25-NBD-Cholesterol制备带有荧光的脂质体，与微泡连接后在荧光显微下观察，证实脂质体在微泡表面的有效粘附。通过观测流式细胞仪检测中吸收曲线的变化，验证新型多聚体微泡-药物复合体中药物舒尼替尼的有效加载。离体实验中，将体外培养的人肾癌GRC-1细胞随机分为6组：空白对照组(Control)、单纯微泡组(MB)、单纯脂质体组(Lipsome)、舒尼替尼组(Sunitinib)、加载有舒尼替尼的新型多聚体微泡不联合超声组(pMBS-US)和加载有舒尼替尼的新型多聚体微泡联合超声组(pMBS+US)。通过改变各实验组不同的药物浓度和作用时间，应用MTT法观察不同处理组的细胞生存率，应用Caspase-3抗体与FITC荧光共同染色法检测细胞凋亡，应用DAPI荧光染色法观察凋亡细胞的核变化，同时应用透射电子显微镜观测凋亡细胞微结构的变化。在体实验中，采用引瘤后原代细胞培养注射细胞悬液法建立裸鼠RCC皮下移植瘤模型，并随机分为空白对照组(Control)、多聚体微泡组(pMB)、单纯舒尼替尼治疗组(Sunitinib)和加载有舒尼替尼的新型多聚体微泡联合超声治疗组(pMBS+US)共4组。采用体内循环体外抽检的方法进行新型多聚体微泡-药物复合体在体循环稳定性的检测，应用超声仪实时监测不同实验组裸鼠肿瘤生长变化并描绘肿瘤生长曲线，同时应用Micro-CT检测评估肿瘤的发展转移情况，随时观察记录药物舒尼替尼相关不良反应的发生。结果新型多聚体超声微泡的平均直径为3.17μm，浓度为3×10~9/mL，含药脂质体的平均粒径为165nm，其对舒尼替尼的包封率约为78%。荧光显微镜下脂质体有效粘附在微泡表面。流式细胞仪结果显示，药物舒尼替尼成功加载于新型多聚体微泡-药物复合体中。离体实验中，结果显示载药新型微泡复合物对人肾癌GRC-1细胞有明显的生长抑制及促进凋亡作用，其中，pMBS+US组对该肿瘤细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用强于其他处理组及对照组，且抑制程度随作用时间的增长和作用药物浓度的增加而增加。在体实验中，结果显示载药新型微泡复合物对裸鼠RCC有明显的生长抑制作用，其中，pMBS+US组对该肿瘤生长的抑制作用与其余各组相比有明显统计学差异，甚至优于单纯使用药物治疗。以上体内实验的结果与体外实验结果相对应，具有前后一致性。结论无论是体内还是体外实验，最有效的RCC治疗方案都需要新型多聚体载药微泡、有效的药物舒尼替尼及超声的定点照射，且无论是体内还是体外实验，pMBS+US组都能显著抑制肿瘤细胞的增殖。新型多聚体微泡携带药物舒尼替尼在超声作用下能显著促进药物与肿瘤细胞的相互作用，可显著提高对裸鼠RCC移植瘤的生长抑制效应，同时降低药物不良反应的发生。为肿瘤靶向治疗提供了一种新型、有效的药物载体，从而为治疗肿瘤时靶向持续的药物运输提供了可能。