染色体微缺失和微重复与许多疾病的发生有关,22ql1.2微缺失综合征、22q1 1.2微重复综合征以及7q1 1.23微缺失综合征和7q1 1.23微重复综合征均属于较常见的染色体遗传病。这类疾病患者的临床表型复杂多样,危及到人体多个器官的正常发育,且预后不良,因此早期筛查和诊断极为重要。实时荧光定量PCR技术作为重要的检测手段,已经广泛地应用于基因突变、基因拷贝数变异等的检测,具有检测时间短、灵敏度高、特异性好、闭管操作无污染、自动化程度高等优势。本课题利用实时荧光定量PCR技术结合DNA序列相似性原理,检测上述常见的4种染色体微缺失和微重复。荧光探针可与靶序列和内参序列特异性结合,随后发生熔解产生具有不同Tm值(DNA熔解温度)的产物峰,可根据专业软件给出的峰高值(Rm)计算靶序列与参考序列的Rm比值(Ratio值),以实现对待测基因拷贝数的相对定量。因参考序列与检测靶序列具有高度相似性,设计一对引物即可实现对靶序列和相似序列的同步扩增,保证了 PCR扩增效率的一致性。最后,通过将多个检测片段得到的Ratio值进行归一化处理后求平均,即为待测标本的相对拷贝数。本课题针对22q1 1.2微缺失综合征、22q1 1.2微重复综合征关键缺失/重复区域中的2个基因DGCR5和UFD1L,共8个检测位点设计引物探针,经过筛选,最后选择其中的3个检测位点,2个位点位于DGCR5,1个位点位于UFD1L上,参考基因序列分别位于chr17,chr18和chr22三个不同的染色体上。实验结果表明,检测体系单个反应可以检测出低至5ng的DNA模板;两次相同实验之间所得数据的一致性强,P>0.05(Student’s test),两次实验结果之间无统计学差异;3种基因型人工质粒标准品可以良好地区分,可模拟实际检测中阴、阳性标本的区分效果。在标本检测中,共检测随机血液基因组标本805份并计算相对拷贝数,得到其 SD 值为 0.0610,CV 值为 0.0629,阈值范围为 0.9699±0.1220(mean±2SD)。另外,共检测唾液标本196份,其SD值为0.0691,CV值为0.0712,阈值范围为0.9700±0.1380(mean±2SD)。唾液标本与血液标本阈值范围接近,但唾液标本稳定性稍差,这与唾液标本的质量相对较差分不开。四份临床标本经盲检,结果为:一份杂合缺失标本为0.4842,两份野生型标本分别为0.9325和1.0066,一份重复型标本为1.9709,该体系检测结果与临床结果一致。我们同样对7q11.23微缺失综合征和7q11.23微重复综合征关键缺失/重复区域中的BAZ1B基因、WBSCR2W与ELN的间隔区和基因GTF2IRD1设计引物探针,共8个检测位点,经过筛选,最后选取3个检测位点,其中2个位点位于GTF2IIRD1,1个位点位于WBSCR28与ELN的间隔区,参考基因序列分别位于chr7上的基因RABGEF1和LOC100420647上。实验结果表明,体系可以检测出低至1.25 ng的DNA模板;3种基因型质粒标准品可以良好地区分;两次相同实验得到的数据一致性高,P>0.05(Student’stest),两组数据无统计学差异,体系的重复性好。在随机标本检测中,共检测血液标本839份并计算其相对拷贝数,其 SD 值为 0.0417,CV 值为 0.0413,阈值范围为 1.0097±0.0965(mean±2SD)。共检测唾液标本206份,SD为0.0466,CV值为0.0476,阈值范围为0.9798±0.0932(mean±2SD)。唾液标本与血液标本稳定性很接近。四份临床标本盲检的结果显示一份杂合缺失型标本为0.5820,两份野生型标本分别为0.9779和1.0754,一份重复型标本为1.5920,检测结果与临床诊断结果一致。现有的临床诊断方法大多费时费力、价格高昂,相比之下,本课题使用的基于DNA相似序列原理的实时荧光PCR熔解曲线分析法具有诸多优点,如简单、快速、灵敏、高通量、自动化、闭管操作无污染、价格低廉,是一种适合临床应用和推广的产前诊断和早期筛查的有效手段。