本文分析了Oct4对放疗诱导的宫颈癌细胞发生放疗抵抗和EMT作用。本研究分为三个部分：　　第一部分：人宫颈癌耐放疗细胞株的建立及特性检测。　　目的：建立稳定的人宫颈癌耐放疗细胞株并检测其有关特性，为开展后续实验做好准备工作。　　方法：⑴选取两种人宫颈癌细胞株Hela和Siha（亲本细胞）进行培养，期间予以X射线反复多次照射处理，照射剂量2 Gy/次，每周两次，累积剂量达到70 Gy后停止照射。将存活的细胞继续培养并传5代以后分别命名Hela-R和Siha-R。⑵采用以下方法比较Hela-R、Siha-R及各自亲本细胞的有关特性：显微镜下观察放疗前后Hela、Hela-R、Siha和Siha-R的细胞形态；克隆形成实验检测在不同剂量梯度照射下上述各细胞（0、2、4、6和8 Gy）的放射敏感性；分别计数0、4和8Gy照射后细胞的平板克隆形成数目；流式检测6Gy和12 Gy照射后48小时细胞的凋亡率；激光共聚焦显微镜观察5Gy照射后24小时细胞核内γ-H2AX forci的数目；分别采用PCR和Western Blot检测RAD21、TGF-β1与Oct4以及EMT相关分子标志物E-cadherin、N-cadherin及Vimentin等基因的转录水平与蛋白表达水平；Transwell小室及Matrigel基质胶检测放疗前后细胞迁移侵袭能力的变化。　　结果：与各自亲本细胞相比，Hela-R和Siha-R的细胞形态呈去细胞极性和细长梭形样改变。克隆形成实验提示Hela-R和Siha-R对射线的敏感性降低。4 Gy和8 Gy照射后Hela-R和Siha-R的克隆形成数目明显增加。照射6和12 Gy后耐放疗细胞株的细胞凋亡率明显降低。5 Gy照射后24小时Hela-R和Siha-R细胞核内的γ-H2AX forci数目明显减少。PCR和Western Blot检测发现，Hela-R和Siha-R中RAD21、TGF-β1、Oct4、N-caherin以及Vimentin的转录和蛋白表达水平增高，而E-cadherin的转录和蛋白表达水平降低。Transwell小室及 Matrigel基质胶实验检测发现，Hela-R和 Siha-R的迁移侵袭能力明显增强。　　结论：建立的耐放疗细胞株Hela-R和Siha-R的放射敏感性降低，产生了放疗抵抗的特性。耐放疗细胞株中RAD21、TGF-β1和Oct4的表达上调，并且耐放疗细胞株发生了EMT以及迁移侵袭能力增强。　　第二部分：siRNA下调Oct4对耐放疗细胞株放疗抵抗性和EMT的影响。　　目的：探讨Oct4与宫颈癌细胞株放疗诱导的放疗抵抗以及EMT之间的关系。　　方法：⑴将Oct4-siRNA转染耐放疗细胞株，Western Blot检验其转染效率。⑵采用以下方法分别检测转染 Oct4-siRNA的耐放疗细胞以及转染空载体细胞的相关特性的改变：克隆形成实验检测不同剂量梯度照射（0、2、4、6和8 Gy）后放射敏感性的变化情况；激光共聚焦显微镜观察照射5 Gy后24小时细胞核内残存的γ-H2AX forci数目；流式检测照射6 Gy和12 Gy后48小时细胞的凋亡率；Western Blot检测EMT相关分子标志物 E-cadherin、N-cadherin和 Vimentin的表达水平；Transwell小室及Matrigel基质胶实验检测迁移和侵袭能力的改变情况。　　结果：与转染空载体对照组相比，转染 Oct4-siRNA后耐放疗细胞株发生如下改变：Oct4表达水平显著下降；克隆形成实验结果显示其放射敏感性增强；5 Gy照射后24小时细胞核内残存的γ-H2AX forci数目明显增多；照射6 Gy和12 Gy后48小时转染Oct4-siRNA的耐放疗细胞凋亡率升高；E-cadherin表达水平降低， N-cadherin和Vimentin表达水平升高；Transwell小室及Matrigel基质胶实验显示其迁移和侵袭能力降低。　　结论：Oct4可能是介导放疗过程中宫颈癌细胞株产生放疗抵抗，并发生EMT和迁移侵袭能力增强的重要因素之一；下调Oct4的表达可起到放射增敏和逆转EMT及抑制迁移侵袭的作用。　　第三部分：耐放疗细胞株中RAD21和TGF-β1对Oct4的调控作用研究。　　目的：探讨耐放疗细胞株中RAD21和TGF-β1对Oct4的调控机制。　　方法：⑴分别构建针对RAD21、TGF-β1和Oct4的siRNA，将其转染入耐放疗细胞株（Hela-R和Siha-R），Western Blot检测上述三个指标的变化情况。⑵ChIP实验检测RAD21结合到TGF-β1启动子区的能力。⑶构建RAD21过表达质粒，将其分别转染入Hela和Siha，检测RAD21、TGF-β1和Oct4的表达水平。⑷用TGF-β受体抑制剂LY2109761处理（10 umol/L）耐放射细胞株，然后完成以下检测：不同剂量梯度照射后克隆形成实验检测其放射敏感性的变化；5 Gy照射后24小时共聚焦显微镜观察细胞核内残存的γ-H2AX forci数目；给药处理后48小时检测Oct4的表达水平；Transwell小室及Matrigel基质胶实验检测其迁移和侵袭能力的变化。　　结果：下调RAD21后，耐放疗细胞株的 TGF-β1和 Oct4表达水平均降低。下调TGF-β1则引起耐放疗细胞内Oct4表达降低，但对RAD21表达无明显影响。下调Oct4对耐放疗细胞株内RAD21和TGF-β1的表达水平无明显影响。ChIP实验证明RAD21可结合到TGF-β1启动子区域。另一方面，过表达RAD21可促进亲代细胞内TGF-β1和Oct4表达。LY2109761可抑制耐放疗细胞株内Oct4表达。下调RAD21或者使用抑制剂LY2109761可增加耐放疗细胞株放射敏感性，并逆转EMT及抑制迁移侵袭。　　结论：RAD21和TGF-β1可调控Oct4的表达；RAD21可结合到TGF-β1的启动子区域并促进TGF-β1的表达；下调RAD21或者使用 TGF-β受体抑制剂LY2109761可起到放疗增敏效应并降低Oct4表达及抑制肿瘤侵袭能力。