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降解微生物固定化处理能够有效解决游离降解微生物在环境修复中适应性差的问题,是污染环境生物修复的必要手段之一。传统的微生物固定化方法均不同程度地存在缺点,极大地限制了生物修复技术的实际应用。因此,开发保护作用充分,且传质性能优良的微生物固定化技术,可为生物修复技术在环境修复中实际应用提供技术支持。本文以聚阳离子电解质壳聚糖（chitosan,CHI）和聚阴离子电解质海藻酸钠（alginate,ALG）为固定化材料,制备出层层自组装（layer by layer assembly,LBL）微囊,将一株芘降解菌微黄分支杆菌CP13封装于微囊中。在对比微囊法与传统固定化法对土壤中芘的修复效果和基础上,全面考察了微囊固定化CP13对不同芘初始浓度、pH、温度、盐度四种环境因素的适应性以及降解过程中土壤微生物群落演替规律,明确了微囊固定化促进CP13对芘修复效果的机制以及生态风险。同时,研究了CP13的胞外聚合物（Extracellular polymeric substances,EPS）与微囊材料之间的相互作用,探讨微囊提升CP13的环境适应性及降解性能的机制。论文主要结论及创新点如下:1.利用LBL自组装原理,以CaCO3为模板,应用CHI和ALG制备出一种LBL微囊。通过微观形貌表征,发现:微囊整体形状为片状,高200-400 nm,长3-4μm,微观呈多孔结构,大部分为介孔。生物培养降解实验结果,与游离菌相比,LBL微囊固定化降解菌对环境因子表现出较强的环境适应性,可适应更高的污染浓度、更宽泛的温度和酸度范围及更高的盐胁迫环境。这可能是由于封装微生物的囊壁聚电解质材料处在外界环境与细菌之间,为降解菌起到壁垒的作用,有利于维持细菌内部的pH值恒定,避免细菌的酸化。同时,LBL微囊具有较高的的孔隙率,能有效保证氧气和底物的输送以及产物的自由扩散,避免累积,有利于降解菌的存活、生长、繁殖和代谢。2.将LBL微囊固定化微生物用于芘污染土壤修复实验,结果表明:固定化菌剂对芘的去除率、酶活及芘降解菌数量均高于游离菌,能显著提高污染土壤的微生物多样性,有利于改善土壤生态质量。LBL微囊处理土壤中的优势门类主要为Proteobacteria和Actinobacteria,优势菌属则包括Xanthomonadaceae、Planococcaceae、Pseudomonas、Mycobacterium、Sphingomonadaceae、Acinetobacter、Flavobacterium、Comamonadaceae、Bacillus、Sphingobacterium、Enterobacteriaceae及Streptomyces。其中,检测到的Pseudomonas、Bacillus、Sphingobacterium和Comamonadaceae是广泛报道的多环芳烃降解菌,而Enterobacteriaceae和Streptomyces鲜有报道具有降解多环芳烃的能力。在LBL微囊处理中还发现一些著名的photosynthesis类细菌,如绿弯菌Chloroflexus,该类细菌能够在降解过程中产生O2,有利于提高土壤氧含量,促进微生物对污染物的代谢。LBL微囊固定化菌剂处理土壤的细菌多样性提高,进一步证实该处理土壤中污染物的大量去除。芘降解效率及修复效果的提高与多环芳烃降解微生物种类及土壤微生物多样性增加之间存在正相关性。3.应用流式细胞术,分别考察了游离态CP13及LBL微囊固定化CP13在降解芘过程中的细胞生理特性,结果显示:降解过程中,过量芘及其中间产物会持续对游离CP13的细胞膜结构造成破坏,使细胞膜通透性增大,膜电位降低,甚至可使细胞膜破裂,膜完整性受到严重破坏,最终造成降解菌的死亡。LBL微囊固定化处理可有效减缓细胞膜结构的破坏及膜电位的降低速度和幅度,显著降低细胞的死亡速度及死亡数量,对降解菌的细胞膜具有明显的保护作用。4.借助三维荧光光谱、圆二色光谱、红外光谱及激光光散射分析等多种分析手段,研究了细菌CP13的胞外聚合物EPS与LBL微囊材料的相互作用,结果表明:LBL微囊中的CHI与微生物的EPS蛋白质组分之间具有结合能力,两者结合生成稳定的基态物质,引起静态荧光淬灭,两者相互作用产生的CHI-EPS复合物表现出比原始EPS大幅增大的平均分子量,也扩张了原始EPS的Z-轴均方旋转半径和水力学半径,降低了EPS的内部密度,使得EPS结构舒展,构型变得疏松,从而提升微生物胞外传质性能和对污染物的俘获效率,最终促进微生物对芘的降解。本课题开发出的LBL自组装微囊固定化降解菌技术,可为微生物修复技术在环境修复中的推广应用提供技术支持。