研究背景在全球范围内,急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）的发病率呈现不断增长趋势,每年约有200万人死于AKI。中国临床研究数据显示,在普通住院患者中AKI的发病率为3.19%,而在ICU其发病率更高达30%。AKI与患者病死率以及慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）的发生发展密切相关,给个人、社会经济和公共卫生带来了巨大的负担。因此,如何防治AKI进展为CKD已成为当前肾脏病研究工作中的一个重点和热点。既往认为AKI是一种急性可逆性损伤,受损的肾脏组织能够逐渐恢复正常。然而,近年来对于AKI患者远期预后的临床研究结果显示,与出院后肾功能正常的AKI患者相比,出院后肾功异常的AKI患者通常快速进展为CKD,甚至进展至终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）,患者的死亡风险度也明显增加。即使是出院后肾功能正常的AKI患者,与无AKI病史的患者相比,也更容易发展为CKD。所有这些临床研究提示,AKI是导致CKD发生发展的独立危险因素。然而,AKI是如何导致CKD的发生发展的,其具体机制还不完全清楚。肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）在调节血压及体液平衡的过程中发挥重要作用。RAS包括血管紧张素原（AGT）,肾素（renin）,血管紧张素转换酶（ACE）和血管紧张素II受体（ATI和AT2）。在正常生理情况下,RAS主要存在于循环系统,其成分由肝脏、肾脏以及肺等全身不同器官分泌产生,受到严格的调控。然而近十几年研究发现,当肾脏受损时病变肾脏可激活所有RAS成分,而异常激活的RAS促进了高血压、CKD以及心血管疾病的发生发展。因此,临床上应用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）或血管紧张素II受体拮抗剂（ARB）等药物作为治疗高血压和CKD的重要方法。但这些药物在阻断RAS时常伴存“血管紧张素II逃逸”现象,所以除了 ACEI、ARB类药物外,亟需新的治疗策略来阻断或延缓高血压和CKD的进展。Wnt/β-catenin是一个进化上高度保守的信号通路,在器官发育、组织再生和肿瘤发生等诸多过程中发挥关键作用。Wnt是一类分泌的糖蛋白,其家族含有19个成员。经典的Wnt信号传递途径依赖细胞内β-catenin。当Wnt蛋白与跨膜的卷曲蛋白受体Frizzled（Fzd）和共受体即低密度脂蛋白（LDL）受体相关蛋白（LRP5/6）相互作用后,诱发一系列下游级联信号效应,最终导致β-catenin转位至核内并与核转录因子即T细胞因子（TCF）/淋巴增强结合因子（LEF）相结合,刺激Wnt靶基因的转录。正常情况下,当肾脏发育完成后,Wnt/β-catenin信号变为静息状态。我们课题组研究表明,Wnt/β-catenin信号通路在多种AKI、CKD动物模型及慢性肾脏病患者中被重新激活,且激活的β-catenin主要定位于肾脏小管上皮细胞。更有意义的是,我们发现RAS所有成分,包括AGT、ACE、肾素、ATI和AT2都是Wnt/β-catenin信号的下游靶基因,它们的表达直接受到β-catenin的调控。据此推测Wnt/β-catenin信号可能在促进AKI进展到CKD的过程中发挥重要作用,并通过调控其下游靶基因RAS的激活促进CKD相关高血压的发生、发展。我们课题组前期研究表明,Wnt/β-catenin信号在肾纤维化的发展中起着重要作用,因此我们推测阻断该信号可能抑制AKI进展到CKD,延缓CKD相关高血压的发生。由于肾脏疾病时多种Wnt基因被激活,所以抑制单一的Wnt表达难以阻断CKD进展。而所有Wnt的经典信号途径均依赖于β-catenin,因此靶向抑制β-catenin可能是一个干预肾纤维化和CKD进展的特异、有效的理想靶标。β-catenin被激活后,它在细胞核内与TCF/LEF转录因子组成复合物,再募集共活化因子即环磷酸腺苷AMP反应元件结合蛋白（CREB）结合蛋白（CBP）,从而激活Wnt/β-catenin通路靶基因的转录。因此,干扰β-catenin/CBP的结合可能是抑制Wnt/β-catenin转录活性的有效策略。近来研究发现一个小分子类肽类化合物ICG-001能选择性抑制体内外β-catenin所介导的基因转录。ICG-001的作用机理非常独特,它能够通过结合CBP从而选择性干扰β-catenin/CBP的相互作用。最近的研究己证明,ICG-001在小鼠模型上能够阻断甚至逆转肾脏纤维化。至于ICG-001能否抑制AKI进展到CKD,延缓CKD相关高血压的发生发展尚无相关研究。因此,本课题主要从以下两个方向研究Wnt/β-catenin信号通路在调控AKI到CKD进展以及CKD相关高血压中的作用:1、在体内部分,我们用肾缺血再灌注损伤动物模型探讨了 Wnt/β-catenin信号通路对AKI进展到CKD的调控作用以及小分子抑制剂ICG-001的干预效果;在体外实验,我们用Wnt条件培养液孵育肾成纤维细胞（NRK-49F）,模拟Wnt/β-catenin信号对成纤维细胞的增殖激活作用。2、在体内实验,我们用血管紧张素II微泵灌注和5/6肾切除动物模型研究了 Wnt/β-catenin信号通路和CKD相关高血压之间的联系,并用ICG-001靶向抑制β-catenin信号以阻断CKD相关高血压的发展;在体外实验,我们用肾小管上皮细胞（HKC-8）过表达Wntl和β-catenin,探讨了 Wnt/β-catenin信号通路对RAS的激活作用。本课题的研究为防治AKI进展到CKD、抑制CKD相关高血压的发展提供了一个新颖、有效的靶点和途径。第一章持续激活的Wnt/β-catenin信号促进AKI进展到CKD目的研究Wnt/β-catenin信号通路对AKI进展到CKD的调控作用,并探讨靶向抑制β-catenin信号对防治AKI进展到CKD的有效性及可行性。方法一、动物实验1.轻度及重度IRI对Wnt/β-catenin信号通路的影响:雄性C57BL/c小鼠随机分为假手术组、轻度肾缺血再灌注组及重度肾缺血再灌注组。采用双侧肾缺血再灌注损伤（bilateral ischemia/reperfusion injury,BIRI）动物模型:模拟急性肾损伤（AKI）向慢性肾脏病（CKD）发展的过程。在IRI术后10天,肾渐至纤维化为主要特点。假手术组只暴露肾蒂而不夹闭肾蒂;轻度BIRI组用微型动脉夹夹闭双侧肾动脉20min;重度BIRI组夹闭双侧肾动脉30min。分别于术后第1、3和10天处死动物,收集血液和肾脏,分别用于肾功能检测、RT-PCR 及 Western blot。2.过表达Wntl对AKI进展到CKD的影响:雄性BALB/c小鼠随机分为假手术组、单侧肾缺血再灌注损伤空载质粒组（UIRI+pcDNA3）和单侧肾缺血再灌注损伤Wntl质粒组（UIRI+pHA-Wntl）。采用夹闭左侧肾蒂30min,其中模型组在术后第5天通过尾静脉给予注射pcDNA3或pHA-Wntl质粒。术后第10天切除小鼠右肾,第11天处死动物,收集血液和肾脏,分别用于肾功能检测、免疫组化、免疫荧光、Real-time PCR及Western blot。3.靶向抑制Wnt/β-catenin信号对AKI进展到CKD的影响:雄性BALB/c小鼠随机分为假手术组、单侧肾缺血再灌注损伤空白对照组（UIRI+Vehicle）、单侧肾缺血再灌注损伤治疗组（UIRI+ICG-001）。采用夹闭左侧肾蒂30min,其中模型组在术后第5天,每天腹腔注射PBS或ICG-001。术后第10天切除小鼠右肾,第11天处死动物,收集血液和肾脏,分别用于肾功能检测、免疫组化、免疫荧光、Real-time PCR及Western blot。4.肾功能检测:分别使用DICT-500肌酐试剂盒检测血清肌酐（Scr）,DIUR-500尿素氮试剂盒检测尿素氮（BUN）。5.RT-PCR检测轻度IRI和重度IRI第1、3和10天各种Wnt mRNA的表达。6.Western blot检测轻度IRI及重度IRI第1、3和10天β-catenin蛋白的表达。7.应用Masson染色观察肾脏胶原纤维的沉积,免疫组化检测Wntl、β-catenin、α-SMA、MMP-7、renin等蛋白的表达部位和变化。8.免疫荧光检测Fibronectin的表达部位和变化。9.Real-time PCR 检测 α-SMA、Fibronectin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、Snail 1、MMP-7 及 FSP1 mRNA 的表达。10.Western blot 检测 Wnt1、β-catenin、Fibronectin、α-SMA、PAI-1 蛋白的表达。二、细胞实验1.Wnt条件培养液的制备:选择前期动物实验证实表达升高的Wnt质粒,包括Wnt1、2、3a、4和16等。用这些Wnt质粒转染肾小管上皮细胞（HKC-8）48小时后,收集细胞上清并离心,即得到Wnt条件培养液。用0.22μm微孔滤膜过滤后分装-20℃保存。2.Wnt条件培养液对肾纤维细胞增殖作用:用不同浓度的Wnt条件培养液处理NRK-49F细胞24小时;一些实验中NRK-49F细胞先与ICG-001孵育30min后,再用Wnt条件培养液共同孵育24小时后,收集细胞,分别用于细胞计数,MTT和BrdU检测。3.Wnt条件培养液对肾纤维细胞的转化作用:NRK-49F细胞用10%浓度的Wnt条件培养液处理细胞24小时后收集细胞;或弃去Wnt条件培养液换成正常培养液再孵育细胞24小时;用40%浓度的Wnt条件培养液处理细胞48小时。在一些实验中NRK-49F细胞先与ICG-001孵育30min后,再用不同浓度Wnt条件培养液共同孵育24或48小时。24或48小时后,收集细胞,分别用免疫荧光检测Fibronectin、Vimentin和Collagen Ⅲ的表达;Western blot 检测 Fibronectin 蛋白的表达;以及 Real-time PCR 的检测 Fibronectin、FSP1、Collagen Ⅰ 和 Collagen Ⅲ mRNA 的表达。结果一、动物实验（一）、轻度和重度IRI对Wnt/β-catenin通路的影响1.肾功能检测结果表明,与假手术组相比,轻度IRI组小鼠的Scr水平在术后第1天显著升高（F=29.292,P=0.000）,术后第3、10天时Scr恢复正常;重度IRI组的Scr水平在术后第1天显著升高（F=l 14.061,P=0.000）,而术后第3、10天时Scr仍未恢复正常。2.RT-PCR结果发现:与假手术组相比,轻度IRI组小鼠的许多Wnt mRNA的表达水平在术后第1天明显升高,术后第3天开始逐渐下调,到第10天时恢复正常,如Wntl、2、3、3a、7a、8a、8b及Wnt16等;同样,重度IRI组的许多Wnt mRNA的表达水平在术后第1天显著升高,到术后第10天时仍持续表达上调,如 Wntl、3a、4、5b、7a、7b、9b、10a、10b 及 Wnt16等。3.Western blot结果显示:与假手术组相比,轻度IRI组小鼠的β-catenin蛋白的表达水平在术后第3天显著升高（尸=67.095,P=0.000）,第10天表达下调;而重度IRI组的β-catenin蛋白水平在术后第1天即显著升高（F=16.212,P=0.000）,术后第3天为峰值,一直持续到第10天。4.RT-PCR结果表明:在术后第1天,重度IRI组小鼠的许多Wnt mRNA的表达水平明显高于轻度IRI组的Wnt mRNA的水平,如Wntl、2、3、3a、7a、7b、8a、8b、10a、l0b 和 Wntl6 等。Western blot 结果显示:在术后第 3 天,重度IRI组的β-catenin蛋白水平明显高于轻度IRI组的β-catenin蛋白水平（F=41.267,P=.000）。（二）、过表达Wnt对AKI进展到CKD的影响1.肾功能分析结果表明,与假手术组相比,UIRI+pcDNA3组小鼠的Scr和BUN水平明显升高;而UIRI+pHA-Wntl组小鼠的Scr（尸=28.760,P=0.000）、BUN（F=31.719,P=0.000）水平较 UIRI+pcDNA3 组显著升高。2.Masson染色显示:与假手术组相比,UIRI+pcDNA3组小鼠的胶原纤维在肾间质明显增多,而UIRI+pHA-Wntl组的胶原纤维（F=31.719,P=0.000）在肾间质的沉积较UIRI+pcDNA3组更加显著。3.免疫组化结果表明:Wntl、β-catenin、MMP-7和renin分布在肾小管上皮细胞包浆中,α-SMA分布于肾小管间质。与假手术组相比,UIRI+pcDNA3组小鼠的Wntl、β-catenin、MMP-7、renin和α-SMA的表达明显增加;而在UIRI+pHA-Wntl组这些蛋白的表达增加较UIRI+pcDNA3组更为显著。4.免疫荧光结果发现,Fibronectin分布于肾小管间质。与假手术组相比,UIRI+pcDNA3组小鼠的Fibronectin的表达明显增加;UIRI+pHA-Wntl组小鼠表达增加的Fibronectin较UIRI+pcDNA3组更为明显。5.Western blot结果显示:与假手术组相比,UIRl+pcDNA3组小鼠的β-catenin、Fibronectin、α-SMA和PAI-1的蛋白表达明显增加;其中UIRI+pHA-Wntl组小鼠的 β-catenin（F=48.522,=0.000）、Fibronectin（尸 =77.352,P=0.000）、α-SMA（F=78.627,p=0.000）和 PAI-1（F=38.037,P=0.000）的蛋白水平较UIRI+pcDNA3组增加更为显著。6.Real-time PCR结果发现:与假手术组相比,UIRI+pcDNA3组小鼠的α-SMA、MMP-7、Fibronectin、Collagen I、Collagen III 及 FSPImRNA 表达水平明显增加,而 UIRI+pHA-Wntl 组小鼠的 α-SMA（F=12.302,P=0.001）、MMP-7（F=24.334,P=0.006）、Fibronectin（F=15.223,P=0.000）、CollagenI（F=8.064,P=0.000）、Collagen III（F=8.655,P=0.005）及 FSPI（F=26.984,P=0.000）mRNA水平较UIRI+pcDNA3组增加更为显著。（三）、靶向阻断Wnt/β-catenin信号通路对AKI进展到CKD的影响1.肾功能结果表明,与假手术组相比,空白对照组小鼠的Scr和BUN水平显著升高;而 ICG-001 治疗组小鼠的 Scr（F=43.154,P=0.000）、BUN（F=25.984,P=0.000）水平较空白对照组显著降低。2.Masson染色显示:与假手术组相比,空白对照组小鼠的肾胶原纤维在肾间质的沉积明显增多;而ICG-001治疗组的肾胶原纤维（F=116.34,P=0.000）沉积较空白对照组显著减少。3.免疫组化结果表明:与假手术组相比,空白对照组小鼠的β-catenin、renin和α-SMA的表达明显增加；而在ICG-001治疗组,这些蛋白的表达水平较空白对照组显著减少。4.免疫荧光结果发现,与假手术组相比,空白对照组小鼠的Fibronectin的表达明显增加;经ICG-001治疗后,Fibronectin的表达水平较空白对照组明显减少。5.Western blot结果显示:与假手术组相比,空白对照组小鼠的Fibronectin、β-catenin、α-SMA和PAI-1的蛋白表达水平明显增加;而在ICG-001治疗组小鼠的 Fibronectin（F=13.978,P=0.000）、β-catenin（F=17.416,P=0.000）、α-SMA（F=12.615,P=0.000）和 PAI-1（F=24.711,P=0.001）的蛋白表达较空白对照组显著减少。6.Real-time PCR结果发现:与假手术组相比,空白对照组小鼠的α-SMA、MMP-7、Fibronectin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、FSP1 和 Snail1 的 mRNA 表达水平明显增加;经 ICG-001 治疗后,α-SMA（F=24.711,P=0.000）、MMP-7（F=28.216,P=0.000）、Fibronectin（F=17.4,P=0.000）、Collagen Ⅰ（F=13.978,P=0.000）、Collagen Ⅲ（F=12.615,P=0.000）和 Snail 1（F 6.15 8,P=0.000）的mRNA水平较空白对照组显著减少。二、细胞实验1.Wnt条件培养液促进NRK-49F细胞增殖10%或40%的Wnt条件培养液处理NRK-49F细胞24小时后,细胞计数结果显示,NRK-49F细胞数量（F=12.615,P=0.000）显著增加,并呈浓度依耐性;MTT检测结果表明,Wnt条件培养液处理NRK-49F细胞后的OD值（F=12.615,P=0.000）显著增加;BrdU检测结果表明经Wnt条件培养液处理后的NRK-49F细胞增殖明显。而ICG-001能明显抑制Wnt条件培养液对NRK-49F细胞的增殖作用。2.Wnt条件培养液促进NRK-49F细胞活化1)、Western blot结果显示:NRK-49F细胞用10%的Wnt条件培养液孵育24小时后,Fibronectin蛋白表达水平明显升高,再撤去Wnt条件培养液换成正常培养液继续孵育24小时后,其Fibronectin蛋白表达水平显著降低;用40%的Wnt条件培养液孵育NRK-49F细胞48小时后,Fibronectin蛋白表达水平显著升高（F=17.416,P=0.000）,而ICG-001能明显抑制Wnt条件培养液对NRK-49F细胞Fibronectin的表达。2)、Real-time PCR结果发现:NRK-49F细胞经40%的Wnt条件培养液孵育48小时后,其 Fibronectin（F=17.416,P=0.000）、Collagen Ⅰ（F=13.978,P=0.000）、CollagenⅢ（F=12.615,P=0.000）和 FSP1（F=6.158,P=0.000）的 mRNA 水平显著升高;而ICG-001能明显下调上述mRNA的表达水平。3)、免疫荧光结果发现,不同浓度Wnt条件培养液促进NRK-49F细胞分泌表达Fibronectin、Collagen Ⅰ和vimentin,其中40%浓度的Wnt条件培养液促进上述指标的表达较10%浓度更为显著。而ICG-001能明显抑制Wnt条件培养液对NRK-49F 细胞 Fibronectin、Collagen Ⅰ 和 vimentin 的表达。结论1.轻度IRI引起Wnt/β-catenin信号短暂的激活,AKI不会发展为CKD;而重度IRI引起Wnt/β-catenin信号持续的激活,肾损伤由AKI进展为CKD。2.IRI小鼠过表达Wnt1促进Wnt/β-catenin信号通路的持续激活,进一步加重肾损伤,促进AKI进展到CKD。3.用小分子抑制剂ICG-001阻断Wnt/β-catenin信号的持续激活,可抑制肾损伤由AKI进展到CKD。4.持续激活的Wnt/β-catenin信号促进肾脏成纤维细胞增殖激活,从而产生大量细胞外基质,加速肾脏纤维化的进展。第二章 Wnt/β-catenin信号对CKD相关高血压的调控作用目的研究发育信号Wnt/β-catenin对CKD相关高血压的调控作用;探讨靶向抑制β-catenin信号对减轻高血压和肾损伤的有效性及可行性。方法一、动物实验（一）、血管紧张素Ⅱ微泵负荷动物实验1.雄性SD大鼠随机分为假手术组、血管紧张素Ⅱ微泵负荷组（AngⅡ+Vehicle）、ICG-001 治疗组（Ang Ⅱ+ICG-001）。采用血管紧张素 Ⅱ 微泵负荷模型:通过大鼠背部皮下置入微量泵于体内缓慢释放Ang Ⅱ,造成慢性AngⅡ负荷,促进血压升高,是研究高血压肾病及心血管疾病的重要模型。假手术组只暴露动物皮层;模型对照组用已经灌注好Ang Ⅱ的微泵埋植于皮下;治疗组每天腹腔注射ICG-001。分别于术后第1、3和7天尾套法测量大鼠血压。1周后处死动物,收集尿液、血液和肾脏,分别用于尿微量白蛋白、RT-PCR 及 Western blot。2.ELISA方法检测大鼠尿微量白蛋白。3.RT-PCR检测Wnt mRNA表达的水平。4.Western blot 检测 β-catenin、ACE 和 AT1 蛋白的表达。（二）、5/6肾切除动物实验1.雄性SD大鼠随机分为假手术组、5/6肾切除对照组（5/6NX +Vehicle）、用药组（5/6NX + ICG-001）。5/6NX模型的特点是:通过切除大部份肾脏,引起残余肾单位高压力、高灌注和高负荷,该模型与临床CKD相关高血压综合症患者的症状相似,是研究CKD并发高血压的理想模型。假手术组只暴露大鼠腹腔;模型对照组切除5/6肾脏;用药组在术后第6周开始隔天腹腔注射ICG-001,空白对照组腹腔注射PBS。尾套法测量大鼠血压。第12周处死动物,收集尿液、血液和肾脏,分别用于尿微量白蛋白、肾功能分析、免疫荧光、免疫组化、Real-time PCR及Western blot。2.ELISA方法检测大鼠尿微量白蛋白。3.自动生化仪测量大鼠血清肌酐、尿素氮水平。4.免疫荧光检测Fibronectin和Collagen Ⅰ的表达。5.PAS和Masson染色检测肾脏形态变化和胶原纤维沉积情况;免疫组化检测β-catenin、α-SMA、AGT、ACE、AT1、renin、CD3 和 CD68 等蛋白的表达部位和变化。6.Real-time PCR 检测 Fibronectin、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、PAI-1、Rantes 和TNF-α等mRNA的表达水平。7.Western blot 检测 β-catenin、Fibronectin 和 Collagen Ⅰ 等蛋白的表达。二、细胞实验1.NRK-49F细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。待细胞长至70%～80%的浓度时,换成无血清培养基饥饿16小时后,用AngⅡ孵育细胞24小时。24小时后收取细胞,用于检测Wnt mRNA的表达。2.常规培养HKC-8细胞。用HKC-8细胞分别转染空载质粒（pcDNA3）或过表达β-catenin质粒24小时。24小时后再用ICG-001或洛沙坦共同孵育HKC-8细胞24小时。之后收取细胞,用Western blot检测Fibronectin、α-SMA和Snail1 等蛋白的表达。结果一、动物实验（一）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）微泵负荷动物实验1.尾套法测量血压显示:与假手术组相比,AngⅡ微泵负荷组在术后第3天收缩压（SBP）（F=30.329,P=0.000）,舒张压（MBP）（F=31.880,P=0.000）水平开始显著升高,第 7 天时 SBP（F=30.572,P=0.000）,MBP（F=25.819,P=0.000）达到峰值;而ICG-001治疗能显著抑制Ang Ⅱ微泵负荷大鼠高血压的发展。2.ELISA检测结果表明:与假手术组相比,AngⅡ微泵负荷组的尿微量白蛋白（F=14.359,P=0.000）显著升高,经ICG-001治疗后,明显减少AngⅡ微泵负荷大鼠尿微量白蛋白。3.RT-PCR结果显示:与假手术组相比,Ang Ⅱ微泵负荷组大鼠的多种Wnt mRNA表达水平显著上调;而ICG-001的治疗不影响这些Wnt mRNA表达。4.Western blot结果证明:与假手术组相比,Ang Ⅱ微泵负荷组大鼠的β-catenin（F=13.265,P=0.001）、ACE（F=11.539,P=0.002）和 AT1（F=26.597,P=0.000）等蛋白表达水平明显上调;而ICG-001治疗组的这些蛋白的表达水平显著减少。（二）、5/6肾切除动物实验1.尾套法测量血压显示:与假手术组相比,5/6肾切除对照组大鼠在术后第12周时 SBP（F=8.077,P=0.004）,MBP（F=9.105,P=0.003）水平明显水平明显升高;而ICG-001的治疗能显著抑制5/6肾切除大鼠高血压的发展。2.肾功能结果表明,与假手术组相比,5/6肾切除对照组大鼠的Scr（F=69.692,P=0.000）,BUN（F=63.449,P=0.001）显著升高;而经 ICG-001 治疗后,明显下调5/6肾切除大鼠的Scr、BUN水平。3.ELISA检测结果表明:与假手术组相比,5/6肾切除对照组的尿微量白蛋白（F=60.011,P=0.000）显著升高,经ICG-001治疗后,明显减少5/6肾切除大鼠尿微量白蛋白。4.PAS染色显示:与假手术组相比,5/6肾切除对照组大鼠的肾小球增大、硬化比较明显；而经ICG-001治疗后能明显改善上述指标。5.Masson染色显示:与假手术组相比,5/6肾切除对照组大鼠的胶原纤维在肾间质沉积显著增多;而ICG-001治疗组大鼠的胶原沉积（F=102.093,P=0.000）显著减少。6.免疫组化结果表明:与假手术组相比,5/6肾切除对照组大鼠的β-catenin、AGT和renin分布于肾小管上皮细胞包浆中;ACE分布在肾小管刷状缘;AT1分布于肾小管上皮细胞包浆和小管间质中;α-SMA、CD3和CD68主要分布于肾小管间质。与假手术组相比,5/6肾切除对照组的β-catenin、α-SMA、AGT、ACE、AT1、renin、CD3（F=25.573,P=0.000）和 CD68（F=188.483,P=0.000）等蛋白的表达水平明显增加;而在ICG-001治疗组,这些蛋白的表达水平明显减少。7.免疫荧光结果发现,与假手术组相比,5/6肾切除对照组大鼠的Fibronectin和 Collagen Ⅰ表达明显增加;经 ICG-001 治疗后,Fibronectin 和 Collagen Ⅰ的表达明显下调。8.Real-timePCR结果发现:与假手术组相比,5/6肾切除对照组的Fibronectin（F=6.288,P=0.000）、Collagen I（F=15.806,P=0.000）、Collagen III（F=17.767,P=0.001）、PAI-1（F=14.135,P=0.001）、Rantes（F=4.951,P=0.022）和 TNF-α mRNA（F=10.926,P=0.001）mRNA 表达水平显著增加;经ICG-001治疗后,这些mRNA的表达水平明显减少。9.Western blot结果显示:与假手术组相比,5/6肾切除对照组的Fibronectin（尸 =11.485,=0.001）和 Collagen I（F=6.959,P=0.007）蛋白表达显著增加。而在ICG-001治疗组,这些蛋白的表达明显减少。二、细胞实验1.RT-PCR结果发现:用Ang II孵育NRK-49F细胞24小时后,可明显上调许多Wnt mRNA的表达,且呈浓度依赖的方式。2.HKC-8 细胞转染 β-catenin 质粒后,明显增加 Fibronectin、α-SMA 和 Snaill等蛋白的表达。而小分子抑制剂ICG-001以及洛沙坦,可明显抑制这些蛋白的表达。结论1.大鼠血管紧张素II微泵负荷和5/6肾切除模型,都可引起肾脏Wnt/β-catenin信号的激活。2.Wnt/β-catenin信号通路的激活,伴随着肾内RAS系统的活化、高血压的发生发展以及肾脏损伤。3.靶向抑制β-catenin通路,可以降低CKD相关高血压、阻断RAS的表达、减少蛋白尿、抑制肾脏炎症浸润和减轻纤维化,从而有效保护肾功能。4.RAS的激活在Wnt/β-catenin信号介导的肾脏纤维化过程中发挥重要作用。