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研究目的:蛋白质糖基化是一类广泛存在于中枢神经系统的翻译后修饰,糖基化修饰过程易受到疾病干扰而发生改变,异常糖基化则会影响疾病的发生发展,因此阐明糖蛋白糖链的表达变化对揭示其在疾病进程中的生物学作用具有重要意义。乙肝导致肝硬化肝癌等终末期肝病常常合并肝性脑病,氨中毒学说为其主要发病机制之一,但氨毒性与脑部蛋白质糖基化异常之间的关联性仍不清楚。因此,本研究以HBV转基因小鼠及星形胶质细胞为研究对象,探究HBV转基因小鼠脑部糖蛋白糖链在不同时间和空间的分布,揭示乙肝相关肝病发生发展过程中氨毒性与脑部特异性糖蛋白糖链的关联性,并阐明编码特异性糖蛋白糖链的糖基转移酶及相关分子的作用机制。方法:1.通过H&E染色检测HBV转基因小鼠的肝病进程及星形胶质细胞肿胀情况,并联合酶联免疫分析其血氨水平。2.利用凝集素芯片分析8-18月龄HBV转基因小鼠及对照小鼠嗅球、左脑、右脑、中脑及小脑糖蛋白糖链谱。进一步结合凝集素特异性识别的糖链结构,筛选二者间差异表达的糖链,并经过蛋白芯片及凝集素印迹验证。随后通过凝集素组织化学研究差异表达的糖链在小鼠脑部的分布。3.以人脑星形胶质细胞系为研究对象,在体外模拟高氨浓度环境,利用凝集素芯片检测氨对特异性糖蛋白糖链表达的影响,并经过凝集素细胞化学验证。随后通过实时荧光定量PCR和免疫印迹分析编码特异性糖蛋白糖链的糖基转移酶的变化规律。4.利用基因表达干扰技术、钙离子检测及营救实验,研究氨与相关糖基转移酶基因对胞内钙稳态的影响以及参与调控的关键分子。结果:1.HBV转基因小鼠肝脏H&E染色结果显示,其体内发生了慢性肝病恶性转化的过程。酶联免疫分析及脑组织H&E染色结果显示,在HBV转基因小鼠慢性肝病恶性转化的过程中,其血氨浓度显著升高,且星形胶质细胞肿胀。2.小鼠脑组织糖蛋白糖链谱结果显示,随着HBV转基因小鼠慢性肝病的发生发展,其嗅球糖蛋白中凝集素LEL识别的（Glc NAc）2-4、LCA识别的α-Man,α-Glc、NPA识别的High-Mannose,Manα1-6Man及PSA识别的α-D-Glc,α-D-Man,Fucα-1,6Glc NAc、左脑糖蛋白中凝集素DSA识别的β-D-Glc NA,（Glc NAcβ1-4）n,Galβ1-4Glc NAc、NPA识别的High-Mannose,Manα1-6Man、LTL识别的Fucα1-3（Galβ1-4）Glc NAc,anti-H blood group specificity及PSA识别的α-D-Glc,α-D-Man,Fucα-1,6Glc NAc、右脑糖蛋白中凝集素HHL识别的High-Mannose,Manα1-3Man,Manα1-6Man,Man5-Glc NAc2-Asn、WFA识别的Terminating in Gal NAcα/β1-3/6Gal及SBA识别的α-/β-linked terminal Gal NAc,（Gal NAc）n,Gal NAcα1-3Gal,blood-group A和中脑糖蛋白中凝集素HHL识别的High-Mannose,Manα1-3Man,Manα1-6Man,Man5-Glc NAc2-Asn、LTL识别的Fucα1-3（Galβ1-4）Glc NAc,anti-H blood group specificity、PHA-E识别的Bisecting Glc NAc,biantennary complex-type N-glycan、SBA识别的α-/β-linked terminal Gal NAc,（Gal NAc）n,Gal NAcα1-3Gal,blood-group A、SJA识别的Terminal in Gal NAc and Gal,anti-A and anti-B human blood group、MPL识别的Galβ1-3Gal NAc及WFA识别的Terminating in Gal NAcα/β1-3/6Gal的相对丰度较对照小鼠存在显著差异,然而小脑糖蛋白中未发现差异表达的糖蛋白糖链。3.体外模拟实验结果显示,氨浓度升高诱导星形胶质细胞糖蛋白中Galβ1-3Gal NAc显著上调,并经过凝集素细胞化学验证。实时荧光定量PCR和免疫印迹结果显示,氨上调星形胶质细胞中核心1β1,3-半乳糖基转移酶（Core 1β1,3-galactosyltransferase,C1GALT1）,这与Galβ1-3Gal NAc的表达趋势一致。4.钙离子荧光探针染色结果显示,氨诱导的C1GALT1过表达导致星形胶质细胞内Ca2+上调。利用si RNA干扰星形胶质细胞中C1GALT1后,肌醇1,4,5-三磷酸受体-1（Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1,IP3R1）的表达随之下调,且胞内Ca2+稳态失调。营救实验结果表明,下调C1GALT1可逆转由氨诱导的Ca2+上调,而IP3R1激动剂可恢复由C1GALT1诱导的胞内Ca2+稳态失调。5.小鼠大脑蛋白免疫印迹实验结果显示,HBV转基因小鼠大脑中C1GALT1和IP3R1蛋白表达高于对照小鼠。小鼠脑组织钙含量显色结果显示,HBV转基因小鼠大脑中Ca2+含量显著高于对照小鼠。此结果与氨诱导后三者在星形胶质细胞中的表达趋势一致。结论:在HBV转基因小鼠慢性肝病的发生发展过程中,其脑组织糖蛋白糖链谱发生了显著变化。其中,氨作为肝性脑病发生时最重要的神经毒素,显著影响了星形胶质细胞糖蛋白中Galβ1-3Gal NAc的表达,编码该糖链的糖基转移酶C1GALT1在星形胶质细胞中表达升高是引起其上调的主要原因。此外,氨通过诱导C1GALT1表达而调节IP3R1,进而影响星形胶质细胞内钙稳态,而IP3R1激动剂可有效恢复由C1GALT1引起的胞内钙稳态失调。因此,C1GALT1和IP3R1有望作为肝性脑病发生时由氨毒性引起的神经功能失调的治疗靶点。