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空心莲子草Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb是一种原产于南美的水生杂草。它已被公认为是世界上一种具有突出问题的杂草,并被列为中国16种最严重的入侵物种之一。空心莲子草最早于20世纪30年代作为饲料作物引入我国,在我国南方大部分地区均有发生,已成为我国危害最大的杂草之一。目前生物防治被视为空心莲子草最有效的防治方法。莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）作为空心莲子草的专食性天敌被世界各个国家引进并取得了巨大的成功。然而,莲草直胸跳甲在我国最大的问题是受温度的影响很大。根据在湖南省的田间调查显示,莲草直胸跳甲种群在每年的6-7月和10-11月有两个明显的高峰,但在8-9月急剧下降,失去了对空心莲子草的控制。众所周知热休克蛋白（Hsps）在各种生物的温度适应中起着重要作用,热激蛋白的表达与生物体耐受性的产生有密切的关系。前期的研究已经证实了三种热激蛋白基因Hsp70、Hsp21和s Hsp21在莲草直胸跳甲高温耐受能力中起着关键的作用。但是,热激蛋白基因的分子调控机制是不清楚的。为了阐明莲草直胸跳甲感受外界高温后是否通过热激转录因子Hsf调控热激蛋白基因的表达来抵御外界高温保证后代的存活,本研究探讨了莲草直胸跳甲热激转录因子Hsf调控热激蛋白基因Hsp70表达的分子机制,从而提高了我们对莲草直胸跳甲感受外界高温激活AhHsf-AhHsps信号通路促进热激蛋白基因表达的分子机制理解。我们的研究有助于在分子水平上提高对莲草直胸跳甲耐热性机制的理解,了解该跳甲对温度变化的适应性,并预测面对气候变化时如何利用莲草直胸跳甲达到对空心莲子草的防控具有重要意义。主要结果如下:1.鉴定了一种热激转录因子AhHsf并证明了莲草直胸跳甲AhHsf参与调控两个潜在的热激蛋白基因AhHsp 70和AhsHsp21转录表达以及在莲草直胸跳甲的耐热性中起关键作用。本研究分离鉴定到一个热休克因子基因（AhHsf）,并确定了它的两个潜在靶基因（AhHsp70和AhsHsp21）.AhHsf序列分析表明它属于Hsfs基因家族。q PCR结果显示高温可诱导热休克因子AhHsf和两个热休克蛋白基因的表达。RNAi结果证明注射双链AhHsf可显著抑制两个潜在的靶基因AhHsp70和AhsHsp21的表达水平,缩短成虫寿命,降低产卵量,最终导致繁殖力下降。注射dsAhHsp70或dsAhsHsp21也显著影响AhHsf的表达水平。2.莲草直胸跳甲AhHsp70基因启动子的克隆及生物信息学分析本实验通过反向PCR技术克隆获得了944 bp的AhHsp70基因上游启动子序列。生信分析发现AhHsp70基因启动子序列包含许多作用元件。BDGP基因启动子预测显示AhHsp70基因启动子序列在转录起始位点上游-30bp左右有共同的TATA盒子以及转录位点起始于嘌呤碱基在编码区ATG上游-137bp左右,序列为TCATGTTTTATATAAAAGC ATCTCGTGGCTGGCGTTTGTCAGTTCAATCA.JASPAR和Tfsitescan预测显示该启动子上-850bp左右位点处具有转录因子结合位点序列为TATTCCAGATAA.Methprimer分析显示该启动子不含有Cp G岛。3.莲草直胸跳甲AhHsp70基因启动子的活性检测成功构建了5个AhHsp70基因启动子荧光素酶重组报告基因质粒（p GL3-basicHsp70（qdz）-144,p GL3-basic-Hsp70（qdz）-344,p GL3-basic-Hsp70（qdz）-544,p GL3-basic-Hsp70（qdz）-744,p GL3-basic-Hsp70（qdz）-944）.通过脂质体转染成功将重组报告质粒和海肾荧光素酶内参质粒共转染sf 9细胞。双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性发现AhHsp70基因上游序列744bp至944bp之间可能包含核心功能区。q PCR结果显示AhHsp70基因能够在转染细胞sf 9中表达,并在一定时间内随着转染时间的增加而升高。实验结果表明AhHsp70上游序列的重组表达质粒成功转染到sf 9细胞中以及AhHsp70基因启动子含有核心功能区和具有启动活性。4.莲草直胸跳甲热激转录因子AhHsf和AhHsp70启动子的互作分析利用双酶切和同源无缝克隆成功构建了AhHsf的过表达载体PIZ/V5-His-Hsf.将启动子重组载体p GL3-basic-AhHsp70和AhHsf的过表达载体PIZ/V5-His-Hsf共转染sf9 72h后,利用双荧光素酶报告系统检测过表达AhHsf对靶基因AhHsp70启动子活性的影响和荧光定量PCR在转录水平上检测过表达AhHsf对靶基因AhHsp70表达水平的影响。DLR系统结果显示过表达的AhHsf能够增强AhHsp70基因上游启动子的活性。q PCR结果显示AhHsf可以促进转染细胞中AhHsp70表达水平。综上所述,本文成功构建了启动子表达载体p GL3-basic-AhHsp70和AhHsf的过表达载体PIZ/V5-His-Hsf.研究发现了调控AhHsp70表达的重要转录因子AhHsf,并初步揭示AhHsp70的上游调控机制。研究结果在转录水平上发现了AhHsf与AhHsp70上游核心启动子区（-744bp--944bp）结合激活了Hsf-Hsp通路,促进AhHsp70的转录表达保护莲草直胸跳甲免受高温伤害。